骨細胞におけるメカノセンサーとしてのカルシウム活性化カリウムチャネルの機能解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25293319
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 秋山 治彦 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60402830)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松田 秀一 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40294938) ; 宿南 知佐 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 教授 (60303905)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 骨萎縮 / 骨細胞 / カリウムチャネル

Outline of Annual Research Achievements

生体におけるカルシウムチャネルKcnm beta1およびKcnm beta4の骨組織への機能を明らかにするため、アメリカにおいて作製されたKcnm beta1およびKcnm beta4ノックアウトマウスを導入した。しかし、両マウスともに病原性ウイルス感染が明らかとなり、現在、SPF化を実施しているところである。
その間、in vitroでの実験として、マウス頭蓋冠から初代骨芽細胞および大腿骨皮質より骨細胞を単離、培養し、BKチャネルブロッカーであるTEA (tetra-ethyl- ammonium)およびオープナーのIPA(isopimaric acid)を添加し、アルカリフォスファターゼおよびSOSTの発現を解析し、前年度同様、TEAによりKcnm beta1および４の遺伝子発現が上昇するも、IPAでは有為な変化を認めなかった事をconfirmした。
また、坐骨神経結紮マウスモデルにおいて、術後1週目および３週目の骨萎縮を呈した大腿骨の凍結組織切片を作製し、アルカリフォスファターゼ染色およびI型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、Runx2遺伝子発現を解析した。今後、サンプル数を増やしで精査する予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

生体におけるBKチャネルの骨組織への機能を解析するために、Kcnm beta1およびKcnm beta4ノックアウトマウスをアメリカより岐阜大学に導入した。しかし、両マウスともに病原ウイルスに感染していいたため、現在、岐阜大学医学部動物実験施設においてSPF化を行っている所であり、平成２６年度の実験が大幅に遅れてしまっている。

Strategy for Future Research Activity

SPF化が終了したKcnm beta1およびKcnm beta4ノックアウトマウスおよびそれらダブルノックアウトマウスを、生後２ヶ月齢で屠殺し、腰椎および脛骨を摘出し、マイクロCTおよび硬組織切片による骨形態計測による骨組織解析を行い、骨細胞のメカノセンシングにβサブユニットが重要であるかどうかを決定する。また、それぞれのノックアウトマウスの脛骨は、フィルム法による凍結薄切切片を作製し、Dmp1, Sclerostin, Phex, FGF23, Connexin 43, Pthr1, Mepeの骨細胞での発現を、それぞれの抗体による免疫染色で解析する。
Kcnmβ1または Kcnmβ4ノックアウトマウスとダブルヘミマウスの大腿骨に創外固定器を装着し、外力ストレスを作用させる。三次元マイクロCT画像で形態学的および組織学的な骨リモデリングの解析を実施し、野生型と比較検討する。

Causes of Carryover

平成２６年度は、マウスのSFP化のため研究が遅延したため、直接経費の残金が生じてしまっている。
平成２７年度に平成２６年度分のマウス解析費用が必要となるため、次年度使用額を用いる計画である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

SPF化が終了したノックアウトマウスに対し、マイクロCTによる形態解析および凍結切片における組織学的解析を実施するため、次年度使用額を使用する。