2013 Fiscal Year Annual Research Report
悪性黒色腫における腫瘍免疫の破綻を解明する！～マウスリンパ浮腫モデルを用いて～
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25293361
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
山本 有平 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70271674)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古川 洋志 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00399924)
小山 明彦 北海道大学, 大学病院, 講師 (70374486)
舟山 恵美 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10533630)
林 利彦 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (00432146)
大芦 孝平 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (00640343)
村尾 尚規 北海道大学, 大学病院, 助教 (90706558)
齋藤 典子 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (80374487)
関堂 充 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40372255)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 組織培養・移植学 / 悪性黒色腫 / リンパ浮腫 / 腫瘍免疫 / 転移 |
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| Research Abstract |
マウスリンパ浮腫モデルにおけるin transit転移の機序を解明するため、まずマウスリンパ浮腫モデルの安定的な作成を試みた。マイクロサージャリーの技術を用い、マウスの後肢のリンパ管を10-0ナイロンで結紮し、膝窩領域のリンパ節、脂肪組織を十分に郭清することで、安定的にリンパ浮腫モデルを作成することができた。
作成したマウスリンパ浮腫モデルに悪性黒色腫細胞であるB16F10細胞を移植したところ、3週間前後でin transit転移が出現することを確認できた。しかし、マウスリンパ浮腫モデルに悪性黒色腫細胞を移植しても、in transit転移を認めない群もあり、in transit転移の発生においてリンパ浮腫がどのように関与しているかは更なる検討が必要である。
免疫組織学的染色で、リンパ浮腫後肢に悪性黒色腫細胞を移植した群では原発腫瘍内および腫瘍周囲のCD3陽性T細胞とFoxp3陽性T細胞(制御性T細胞)の数が正常後肢に移植した群と比較して低下している可能性があった。次に原発腫瘍内および腫瘍周囲のFoxp3発現をreal time PCRで検討したところ、現時点でFoxp3のmRNA発現に明確な差を認めなかった。
In transit転移モデルにおいて何らかの免疫学的機序が関与している可能性が示唆されたが、免疫寛容が生じているかはまだ明らかとなっておらず、in transit転移モデル作成時の腫瘍を移植するタイミングなど今後の検証が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス後肢リンパ浮腫モデルの安定的な作成が可能となった。マウス後肢リンパ浮腫に悪性黒色腫細胞を移植した後にin transit転移が成立することも確認できた。免疫組織学的染色で原発腫瘍内および腫瘍周囲にCD3陽性T細胞とFoxp3陽性T細胞(制御性T細胞)を同定することができた。リンパ浮腫後肢に悪性黒色腫細胞を移植した群ではCD3陽性T細胞とFoxp3陽性T細胞(制御性T細胞)の数が正常後肢に移植した群と比較して低下している可能性があり、in transit転移の成立に何らかの免疫学的機序が関与している可能性が示唆された。よって、研究はおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
上皮間葉転換(epithelial to mesenchymal transition、以後EMT)等による腫瘍の性質の変化によりin transit転移が生じている可能性があり、これを証明する。免疫組織学的染色によって原発巣とin transit転移巣との間でE-cadherin、N-cadherin、vimentinなどのEMTのマーカーの発現に差があるかを検証する。原発巣とin transit転移巣の組織からRNAを抽出しreal time PCRなどにより上記のEMTマーカーの発現が遺伝子レベルで差があるか解析する。
また、in transit転移の成立における免疫寛容の有無、制御性T細胞(regulatory T cells、Treg)の病態への関与について前年度に引き続き検証を行う。In transit転移モデル作成時に腫瘍を移植するタイミングなどの実験条件を検討する。免疫組織学的染色ならびにフローサイトメトリーを用いて腫瘍局所および末梢血内のCD4リンパ球内のTregの比率を測定し検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
高額な機器の購入を予定していたが、本年度のみの予算では購入ができなかった。
研究遂行に必要な試薬、抗体(リアルタイムPCR、western blot、フローサイトメトリーなどの実験で使用する)はまだあるが、本年度のみの予算では調整できなかった。
次年度の予算と合わせて、将来の研究に必要な機器を購入する予定である。
また本研究を遂行する上で必要な試薬、抗体(リアルタイムPCR、western blot、フローサイトメトリーなどの実験で使用する)の購入を予定している。また、動物実験に必要なマウスの購入を適宜予定している。
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