レーザーマイクロダイセクションを用いたマウス胎仔皮膚再生の分子機構の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25293363
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 貴志 和生 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40224919)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保田 義顕 慶應義塾大学, 医学部, 准教授 (50348687) ; 林 瑠加 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (50445392) ; 荒牧 典子 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (80365311)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 再生 / 皮膚 / 胎仔 / マイクロアレイ

Outline of Annual Research Achievements

創傷後に皮膚が完全に再生するマウス胎生13日の創傷部位の、表皮および真皮細胞別に、レーザーマイクロダイセクションシステムを用いて、組織切片からRNAを採取した。また、同じマウス胎仔の創傷部位とは反対側の正常部位の表皮および真皮細胞を同様にレーザーマイクロダイセクションを用いて組織別にRNAを回収した。採取したRNAは微量であったため、RNAをcDNAに変換した後、全cDNAの増幅作業を行った後に、創縁と正常部位の表皮どうし、真皮どうしをマイクロアレイを用いて、網羅的に比較した。同様の検索を、皮膚の傷跡が残る胎生15日の創傷部位で行った。その後、胎生13日の創傷部位、もしくは胎生15日の創傷部位でのみ発現の増強が確認された遺伝子の発現が確かなものか否かを、詳細に検討する。胎生13日および胎生15日のマウス胎仔創傷後、さまざまな時間に創縁の表皮または真皮を採取し、同時に反対側正常皮膚から同様に表皮または真皮をレーザーマイクロダイセクションで採取し、採取検体からRNAを抽出し、cDNAに変換した後real time PCRで定量的に、発現の変化を観察した。さらに遺伝子発現の局在を in situ hybridizationを用いて確認作業を行った。またこれら発現遺伝子を、siRNA試薬を用いて、羊水内に投与しin vivoでノックダウンを試み、それぞれの皮膚再生に及ぼすの変化を観察した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

順調にレーザーマイクロダイセクションによるRNAの回収、マイクロアレイ、ノックダウンが行われている。

Strategy for Future Research Activity

比較する遺伝子の数が、多くなるので、クラスター解析を行い、ノックダウンまたはノックアウトする遺伝子を絞り込む。

Causes of Carryover

候補となる遺伝子のノックダウンのためのsiRNA試薬を順次購入していたが、納品が次年度となるため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

引き続き遺伝子のノックダウンのためのsiRNA試薬の試薬購入に充てる予定である。