2013 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子プロモータ領域のCpGアイランドメチル化プロファイルが転写に与える影響
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25330347
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
稲岡 秀検 北里大学, 医療衛生学部, 准教授 (30282768)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | がん / 遺伝子発現 / マイクロアレイ / DNAメチル化 / 転写制御 / バイオインフォマティクス |
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| Research Abstract |
本研究課題では，転写・翻訳され生物学的な機能を発現する遺伝子(機能的RNAを含む)の転写制御の解明を最終的な目標とする．解析対象としては，遺伝子の塩基配列上流に存在し，転写因子が結合することで転写が開始されると考えられるプロモータ領域を選んだ．プロモータ領域中に存在する高密度なCG領域，すなわちCpGアイランドに転写因子が結合すると考えられているが，CpG部位がDNAメチル化と呼ばれる現象によりメチル基が付加されると転写因子の結合が阻害され，転写が抑制されると考えられる．本研究では，プロモータ領域のCpGアイランド全体のDNAメチルプロファイルを解析することで，DNAメチル化が転写制御メカニズムに及ぼす機序を解明することを目的としている．
遺伝子の転写制御メカニズムが正常に機能していない代表例としてがん組織が挙げられる．そのため正常組織とがん組織において，遺伝子発現およびDNAメチル化プロファイルを網羅的に検討すれば，DNAメチル化プロファイルが転写制御に与える影響を検討することが可能となると考えられる．そこで最初の検討項目として正常組織およびがん組織において，遺伝子発現が有意に異なる遺伝子群を同定する．次いで，同定された遺伝子群のDNAメチル化，特に転写制御に大きな影響を与えるとかんがえられるプロモータ領域のCpGアイランドのDNAメチル化状態を調べる．
H25年度は，上述した正常組織とがん組織で発現量が異なる遺伝子群を決定するために，同一サンプルからの遺伝子発現量およびDNAメチル化度を測定した結果を公開している公的データベースのデータを用いた解析を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H25年度は，公的データベースからの情報を用いて，正常組織とがん組織で遺伝子発現が有意に異なる遺伝子群を特定することを目的とした．
遺伝子発現とDNAメチルのデータはThe Cancer Genome Atlas(TCGA) データベースから入手した．TCGAデータベースでは様々な臓器組織における，正常組織およびがん組織からの遺伝子発現量，DNAメチル化，染色体コピー数異常，マイクロRNA発現量などのデータを網羅的に取り扱っている．今回，３種類のがん組織(浸潤性乳がん: BRCA，結腸腺がん: COAD，直腸腺がん: READ)に対してデータ解析を行った．
各組織の実験サンプル数は正常組織(N)，がん組織(T)についてそれぞれBRCA(N:39, T:304)，COAD(N:19, T:155)，READ(N:3, T:69)であった．遺伝子発現量データ(遺伝子数17814)に対して，各遺伝子の平均発現量と分散を調べた．正常組織の平均発現量とがん組織の平均発現量の平均値の差をt-検定を用いて比較し，がんと正常組織で発現量に有意の差が見られた遺伝子を特定した．このデータ解析を３つの組織全てに行い，全組織で共通に発現に有意の差が見られた遺伝子128個を特定した．これらの遺伝子のうち，NCBIのデータベースで遺伝子の染色体上の位置が判明している遺伝子118個をがんで発現が変化する遺伝子群の候補とした．以上の結果を，計測自動制御学会・ライフエンジニアリングシンポジウ2013にて発表した．
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| Strategy for Future Research Activity |
H26年度は培養細胞系を用いて，遺伝子発現とDNAメチル化度の関係を実験により検討することを計画している．まず遺伝子プロモータ領域のDNAメチル化度を人為的に変化させる実験系を確立するため，培養系のヒト肺動脈内皮細胞に対して，培養液中に低濃度から高濃度まで濃度を数段階に調整したメチル化阻害剤を投与し，培養液中のメチル化阻害剤濃度と遺伝子発現量の関係を検討する．
ヒト肺動脈内皮細胞に，H25年度で検討した細胞とは組織が異なっているが，がん組織を実験系に組み込むことは現有する実験系では難しいこと，ヒト肺動脈内皮細胞に関しては，既に培養技術を確立しており，遺伝子発現測定に関してもRT-PCR,マイクロアレイを用いた計測技術に習熟しているため，この培養細胞を実験系として選択した．
がん組織とヒト内皮動脈内皮細胞において共通する転写制御メカニズムを持つ遺伝子群を同定するために，H26年度は以下に述べる実験を計画している．まずヒト肺動脈内皮細胞の実験系において，マイクロアレイを用いて遺伝子発現を網羅的に計測し，メチル化阻害剤の濃度に対して，遺伝子発現量が有意に変化する遺伝子群を同定する．同定された遺伝子群と，H25年度に得られた正常組織とがん組織で有意に発現が異なる遺伝子群について，塩基配列構造の面からの比較を行なう．具体的には，両者の遺伝子プロモータ領域のCG密度やCpGアイランド配列長といった塩基構造を比較する．この比較検討から，同一のプロモータ領域のCpGアイランド構造を持つ遺伝子群を同定し，H27年度に実施予定のDNAメチル化測定実験の対象遺伝子を絞り込む．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
正常ヒト肺動脈内皮細胞の購入単価が112,500円であるため，H25年度使用可能額では3単位しか購入できなかった．培養実験系の確立のためには3単位でも十分であったため，H25年度は3単位までの購入とし，残額にてH25年度に新たに正常ヒト肺動脈内皮細胞を購入する予定である．
H26年度に使用可能な物品費と合わせることで正常ヒト肺動脈内皮細胞の購入に使用する予定である．
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