遺伝子プロモータ領域のCpGアイランドメチル化プロファイルが転写に与える影響

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25330347
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 稲岡 秀検 北里大学, 医療衛生学部, 准教授 (30282768)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: がん / 遺伝子発現 / マイクロアレイ / DNAメチル化 / 転写制御 / バイオインフォマティクス

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では，転写・翻訳されることで生物学的な機能を発現する遺伝子(機能的RNAを含む)の転写制御機構の解明を最終的な目標とする．本研究での解析対象は，転写制御に重要な役割を果たすと考えられている遺伝子プロモータ領域におけるDNAメチル化である．遺伝子プロモータ領域とは，遺伝子の塩基配列の転写開始点の上流に存在し，シトシン(C)とグアニン(G)を豊富に含む領域である．DNA鎖上にCとGが塩基対としてでは無く，塩基鎖の方向に連続して出現する部位をCpG部位という．DNAメチル化とは，このCpG部位にメチル基が付加される現象を言う．遺伝子プロモータ領域にDNAメチル化が生じると，遺伝子プロモータ領域への転写因子の結合が阻害され，遺伝子の転写が抑制されるとされている．本研究課題では，遺伝子プロモータ領域全体のDNAメチルプロファイルを解析し，転写制御とDNAメチル化の関係性を解明することを目的としている．

H25年度は，正常組織とがん組織における遺伝子発現について検討した．がん細胞は無限に増殖するため，転写制御のシステムに異常が発生していると考えられる．この原因の一つとしてDNAメチル化異常が考えられる，そこで公的データベースから複数の臓器における，正常組織およびがん組織からの遺伝子発現データを入手し，正常組織とがん組織で発現量が有意に異なる遺伝子群を同定した．

H26年度は，DNAメチル化異常を強制的に発生させた細胞における遺伝子発現について検討した．ヒト肺動脈内皮細胞の培養実験系を作成し，この培養細胞に濃度依存性のDNAメチル化阻害剤を添加し，DNAメチル化異常を発生させた．DNAメチル化異常が生じたときの遺伝子発現変化について測定した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

H26年度は培養細胞系を用いて，DNAメチル化異常と遺伝子発現との関係を実験により検討した．まず遺伝子プロモータ領域のDNAメチル化度を強制的に変化させる実験系を確立するため，ヒト肺動脈内皮細胞に対して，濃度依存的にDNAメチル化を阻害するメチル化阻害剤を投与した．実験は，非投与群，低濃度群，中濃度群，高濃度群の4群で行った．上記の4群のヒト肺動脈内皮細胞に対し，マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を2回ずつ行った．

非投与群を対照群として，メチル化阻害剤投与群における遺伝子発現の変化を調べた．通常，遺伝子発現に生物学的に意味のある変化が生じたとされる変化率の閾値は，観測群の遺伝子発現量が，対照群の遺伝子発現量の2倍以上あるいは2分の1以下となったときとされる．しかし実際には，遺伝子によって遺伝子発現量の絶対値は大きく異なる．とくに本来の遺伝子発現量が小さい遺伝子では，測定時の誤差により，簡単にこの閾値を超えるものが出現する．一方本来の遺伝子発現量が非常に大きい遺伝子では，2倍を超えるような大きな発現量変化が無くとも生物学的に意味のある変化が生じている場合もある．このように固定の閾値を用いる方法では，生物学的に意味のある発現量変化があった遺伝子を精度良く抽出できない．そこで我々が提唱する適応閾値を用いることで，確実に発現量に変化が見られた遺伝子のみを抽出した．適応閾値とは，対照群の各遺伝子の発現量の信頼区間を求め，この信頼区間により，遺伝子の発現量に応じた適切な値を閾値とするものである．

DNAメチル化阻害剤の投与により，2万近くの遺伝子から，低濃度群，中濃度群，高濃度の全てで阻害剤の濃度に比例して発現量が変化する遺伝子が242個同定された．これらの遺伝子に対し，Gene Ontologyによる遺伝子機能の解析を行った結果，炎症に関与するケモカイン系の遺伝子がクラスタとして存在することが示された．

Strategy for Future Research Activity

H27年度は，H26年度と同様に引き続き培養細胞系を用いて，遺伝子発現とDNAメチル化度の関係を実験により検討することを計画している．

まずH25年度に公的データベースの発現データから得られた，がん細胞と正常細胞で発現量が有意に異なる遺伝子群と，H26年度に培養細胞系の実験から得られたメチル化阻害剤の濃度に比例して発現量が変化した遺伝子群とについて，塩基配列の構造面からの比較を行う．具体的には，両者の遺伝子プロモータ領域のCG含有密度やCpGアイランドと呼ばれるCpG部位が連続する領域の配列長などの塩基構造の比較を行う．この検討により遺伝子プロモータ領域においてCpG含有密度やCpGアイランドの構造に類似性が見られる遺伝子群を同定する．

がん組織とヒト内皮動脈内皮細胞において共通する転写制御メカニズムを持つ遺伝子群を同定するために，H27年度は以下に述べる実験を計画している．H26年度に得られたヒト肺動脈内皮細胞の実験系において，メチル化阻害剤の濃度に比例して遺伝子発現量が有意に変化した遺伝子群と，H25年度に得られた正常組織とがん組織で有意に発現が異なる遺伝子群の双方に共通して存在するCpGアイランド構造に対し，実際にプロモータ領域の網羅的なDNAメチル化計測を行う．プロモータ領域の全体的なDNAメチル化プロファイルを調べることで，転写制御に強く関与するCpG部位を特定する．また公的なデータベースから網羅的では無い部分的なDNAメチル化変動データを入手し，DNAメチル化のばらつきを調べる．本課題から得られた全体的なDNAメチル化プロファイルと，これら部分的なDNAメチル化のばらつきがどのような関係にあるかを検討する．安定してDNAメチル化が生じる部位についても検討する．

Causes of Carryover

マイクロアレイの販売形式が変更となり，１枚ずつの購入ができず5枚ずつの購入となった．そのためH26年度の所要額では端数が出ることとなった．

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に繰り越すことで，必要なマイクロアレイを購入する．