メタン・アンモニア酸化関連微生物検出手法の開発と応用

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25340016
• Research Institution: Shibaura Institute of Technology
• Principal Investigator: 布施 博之 芝浦工業大学, システム理工学部, 教授 (30357925)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: メタンモノオキシゲナーゼ / 短鎖アルカン資化性菌 / アンモニア酸化細菌 / メタン資化性菌

Outline of Annual Research Achievements

従来、アンモニア酸化細菌とメタン資化性菌にしか知られていなかったCu-MMO遺伝子について、先に見出していたエタン資化性菌２株、エチレン資化性菌2株にくわえ、あらたに各１株の菌について、それらの塩基配列と誘導発現を確認した。それらを用いて、環境中における非メタン系Cu-MMO遺伝子の検出を行った。
今年度は、プライマーの改良と各種環境試料への適用を行った。数種類のプライマーについて、実際にPCRを行うことで最も増幅の良いものを選択した。これについては、同時にβ-プロテオバクテリアに属するアンモニア酸化細菌の遺伝子も増幅し、α-プロテオバクテリアのメタン酸化細菌のpmoA遺伝子についてもわずかに薄いバンドが確認されたが、従来のプライマーに比べメタン酸化細菌のpmoA遺伝子の増幅はごくわずかであった。しかし、実際の東京湾の海水・海泥や日本海の海水の試料についてのPCRの結果、やはり増幅は確認されなかった。　そこで、さらにNested-PCRについても検討を行った。エタン資化性菌・エチレン資化性菌のpmoA前後の配列から設計したプライマーを最初に用いたPCRを、上記の環境試料に対して用いた後に上記のPCRを行うことにより、エチレン資化性細菌、エタン資化性細菌のpmoA遺伝子に近縁のクローンが多く検出された。同時に未知のpmoAグループやβ-プロテオバクテリアのamoA遺伝子に近縁なグループも検出され、こうした非メタン系Cu-MMO遺伝子が広く存在することが明らかとなった。。
DGGEを用いた海水中のpmo遺伝子の検出についても検討を行った。海水試料からの直接の遺伝子の増幅は難しかったが、やはり、Nested-PCRを用いることや、PCR手法の改良により、海水試料中のpmo遺伝子の増幅を確認することが出来た。これにより、更に詳しい解析が可能となった。