2014 Fiscal Year Research-status Report
ヌクレオチド除去修復によるアルキル化損傷ＤＮＡの修復開始段階の解析
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25340039
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| Research Institution | Okayama University of Science |
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Principal Investigator |
池田 正五 岡山理科大学, 理学部, 教授 (10176092)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 真二 岡山理科大学, 理学部, 助教 (00600222)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ヌクレオチド除去修復 / アルキル化損傷 / 塩基除去修復 / 分裂酵母 / 損傷認識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年に引き続き、ヌクレオチド除去修復（NER）によるアルキル化損傷DNAの修復開始段階を、分裂酵母を用いて遺伝学的および生化学的に解析した。ゲノム全体を対象としたNERの初期過程に働くrph7とrhp41について、塩基除去修復（BER）でAPサイトに働くnth1とのエピスタシス解析を、脱アミノ剤で種々の変異体を処理して行った。脱アミノ剤はシトシンをウラシルに変換し、さらにウラシルDNAグリコシラーゼによりAPサイトになる。それぞれの単独欠損株よりも、nth1/rph7およびnth1/rhp41欠損株は脱アミノ剤に対して感受性になった。したがって、Rhp7p とRhp41pはDNAグリコシラーゼによって生じたAPサイトを認識してNERに導いていることが判明した。さらに、NERエンドヌクレアーゼRad13pはRad2p（ヒトのFEN1ホモログ）とUV損傷やアルキル化損傷に相加的に作用していることを見いだした。Rhp7p/Rph16p複合体の遺伝子は互いに逆向きに隣接している。これらのプロモーターをレポーターアッセイで測定した。rph16プロモーターはレポーターアッセイでUV誘導性のみならず、アルキル化剤や酸化剤による処理によっても誘導された。種々のDNA損傷に対する誘導性は、Rhp16pがUV損傷以外の修復にも関わっていることを示唆する。rph7プロモーターはこれまでの所、UV誘導性を観察できていない。NERにかかわるヘテロ二量体のRhp41p/Rhp23p（XPC/HR23）とNERエンドヌクレアーゼRhp16p/Swi10p（XPF/ERCC1）を大腸菌で共発現させる系を作製したが、両者ともかなりのタンパク質が不溶性で、現在、培養や抽出方法を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成26年度は、遺伝学的な解析とDNA損傷応答の解析は予測通りの進行具合で実施することができた。すなわち、Rph7pとRhp41pがBERの初発酵素であるDNAグリコシラーゼの作用で生じたAPサイトを認識してNER過程に導いていることを明らかにすることができた。また、NERエンドヌクレアーゼRad13pとRad2pがUV損傷やアルキル化損傷に相加的に作用していることを見いだした。さらに、rph16とrph7プロモーターのレポーターアッセイ系を構築し、rph16プロモーターがUVのみならず、アルキル化剤や酸化剤による処理によっても誘導されることを示した。これにより、DNA損傷に応答するエレメントの同定に発展させることができる。しかし、生化学的解析では苦戦している。Rhp41p/Rhp23p複合体とNERエンドヌクレアーゼRhp16p/Swi10pを大腸菌で共発現させる系では、両者ともかなりのタンパク質が不溶性となり、これら因子の精製に手間取っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は最終年度であり、当初の方針通りに研究を進める。まず、これまでに完了していない遺伝学的解析を行う。さらに大腸菌で発現させたNER因子の精製・機能解析などの生化学的解析行う予定である。最後に、研究の成果を英語論文にまとめたい。
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| Causes of Carryover |
予算の９割以上を使用したが、今年度は出張回数が１回であったり、既存の試薬類を使うことができたので、約30万円の繰越金ができた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度の研究で用いる比較的高価な試薬の購入に充てる予定である。
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