難培養性微生物を標的としたハイスループット分離・培養・代謝機能解析システムの開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25340087
• Research Institution: Nigata University of Phermacy and Applied Life Sciences
• Principal Investigator: 重松 亨 新潟薬科大学, 応用生物科学部, 教授 (10315286)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井口 晃徳 新潟薬科大学, 応用生物科学部, 助教 (60599786)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 微生物分離培養技術 / メタン発酵 / 酢酸利用微生物 / マイクロプレート

Outline of Annual Research Achievements

前年度は、酢酸を唯一の炭素源として供給するメタン発酵プロセスの槽内液にマイクロプレート分離培養法を適用し、培養法によるメタン生成Archaeaの群集構造の解析技術を確立した。しかし、分離培養したマイクロプレートからは、水素資化性メタン生成古細菌は検出されず、嫌気性酢酸酸化細菌と水素資化性メタン生成古細菌による微生物共生系を検出することができなかった。平成26年度は、この微生物共生系を特異的に検出することを目的に以下の実験を行った。
微生物共生系を構成する水素資化性メタン生成古細菌の16S rRNA遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーを検討し、酢酸を唯一の炭素源として供給するメタン発酵プロセスの槽内液から抽出したDNAを鋳型としたPCR実験を行ったところ、この槽内液中にMethanomicrobiales目に分類される水素資化性メタン生成古細菌が存在することが判明した。10の4乗倍あるいは10の5乗倍希釈した培養液を分注して、酢酸を唯一の炭素源とするマイクロプレート分離培養を行った各ウェルの培養液を鋳型として、本プライマーセットを用いたPCRを行った。その結果、10の4乗マイクロプレート14 well、10の5乗マイクロプレート7 wellに水素資化性メタン生成古細菌の存在が示された。本研究の結果、マイクロプレート分離培養法により、酢酸を分解する微生物共生系を含む微生物群集の分離が可能であることが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

酢酸を唯一の炭素源として供給するメタン発酵プロセスの槽内液にマイクロプレート分離培養法を適用した培養液に、酢酸を分解する微生物共生系を含む微生物群集の分離が可能であることが示された。このけっかにより、【検討項目1】特定基質の代謝に関与する嫌気性微生物および微生物共生系の分離培養、【検討項目2】分子生物学的手法による分離培養した微生物および微生物共生系の分類情報の取得手法の確立、については、ほぼ順調に進捗していると考えている。【検討項目3】メタボローム解析による分離培養した微生物および微生物共生系の代謝機能情報の取得手法の確立についてはやや遅れているが、微生物共生系の分離培養が可能であることが示され、嫌気条件での酢酸の代謝産物の分析のための準備が整っている。したがって、研究目的に対して概ね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度は、分離培養した酢酸を分解する微生物共生系を含む微生物群集に限界希釈培養法を適用し、純化を進める。同時に、水素資化性メタン生成古細菌と共生する嫌気性酢酸酸化細菌の分類情報を獲得する。さらに、代謝産物のメタボローム解析を実施する。