非ウイルス性ベクターを用いた遺伝子導入時における細胞間差を生じる機構の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25350553
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 麓 伸太郎 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (70380988)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 遺伝子・核酸工学材料 / 遺伝子導入機構 / エンドサイトーシス / 細胞間差 / リポソーム / 高分子

Outline of Annual Research Achievements

我々は非ウイルス性ベクターを用いたin vivo遺伝子導入法の開発並びに遺伝子導入機構の解析を行ってきた。これまでの解析により、in vivo遺伝子導入において、遺伝子導入効率に著しい細胞間差が存在することを明らかにしている。そこで本研究においては、非ウイルス性ベクターによる遺伝子導入において細胞間差を生じる機構を解明する。現在、細胞取り込み過程に着目し解析を行っている。昨年度、共焦点レーザー顕微鏡およびイメージベースサイトメーターを用いて複数のエンドサイトーシス活性の同時評価を行い、細胞ごとに活発なエンドサイトーシス経路が異なることが示唆されている。このエンドサイトーシスの細胞間差が、非ウイルス性ベクターによる遺伝子導入における細胞間差を生じる要因の一つと考えられる。本年度は、同評価系により細胞周期に関して解析を行った。解析にあたり、ヒト肝ガン由来細胞株HepG2を用い、薬剤による同調実験を行った。ノコダゾールでM期に同調させたところ、エンドサイトーシス活性に大きな変化はみられなかったが、ヒドロキシウレアでS期に同調させたところ、トランスフェリンの細胞取り込みが増大する傾向がみられた。
一方、非ウイルス性ベクターが遺伝子発現に至るためには、核に送達される必要があり、細胞周期に関する解析を行うにあたり、細胞取り込みと遺伝子発現に乖離がある可能性が考えられた。そこで、カチオン性リポソームに核移行を促進するペプチドを添加することで遺伝子導入効率の増大を試みたところ、HepG2細胞において遺伝子発現に至る細胞の割合を平均3倍程度増加することができた。平成27年度は、この系により細胞取り込み活性と遺伝子発現の相関を解析する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度立ち上げた、複数の細胞取り込み経路の活性を同時に評価する実験系を用いて、細胞周期の影響を解析することができた。また、最終年度に向けて、遺伝子導入ベクターの細胞間差を解析する準備も整った。

Strategy for Future Research Activity

イメージベースサイトメーターは同時に2色解析可能であったが、加えて7色同時に解析可能なセルソーターを導入し、複数のエンドサイトーシス活性をモニターしつつ、個々の細胞における細胞周期を同時に解析する実験系を計画し、計画のスピードアップを図る。

Causes of Carryover

次年度使用額は1万円程度で昨年度の繰越額よりも減っており、概ね計画的に執行していると判断する。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度使用額で試薬を購入する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Secure and effective gene delivery system of plasmid DNA coated by polynucleotide. (2015)
  • Author(s): Kodama Y, Ohkubo C, Kurosaki T, Egashira K, Sato K, Fumoto S, Nishida K, Higuchi N, Kitahara T, Nakamura T, Sasaki H
  • Journal Title: J Drug Target Volume: 23 Pages: 43-51
  • DOI: http://dx.doi.org/10.3109/1061186X.2014.950665
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Effect of absorption enhancers on the absorption of FD-4 as a poorly absorbable marker macromolecule from the liver surface in rats. (2014)
  • Author(s): Mine T, Miyamoto H, Yoshikawa N, Fumoto S, Sasaki H, Nakamura J, Nishida K
  • Journal Title: J Drug Del Sci Tech Volume: 24 Pages: 386-389
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S1773-2247(14)50078-0
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Hepatic gene delivery system electrostatically assembled with glycyrrhizin. (2014)
  • Author(s): Kurosaki T, Kawanabe S, Kodama Y, Fumoto S, Nishida K, Nakagawa H, Higuchi N, Nakamura T, Kitahara T, Sasaki H
  • Journal Title: Mol Pharmaceutics Volume: 11 Pages: 1369-1377
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1021/mp400398f
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] HepG2細胞における活発なエンドサイトーシス経路と細胞周期の関連 (2014)
  • Author(s): 宇根隆通、麓伸太郎、宮元敬天、西田孝洋
  • Organizer: 第30回日本DDS学会学術集会
  • Place of Presentation: 慶應義塾大学薬学部（東京）
  • Year and Date: 2014-07-30 – 2014-07-31
• [Presentation] 複数のエンドサイトーシス活性の同時評価 (2014)
  • Author(s): 麓伸太郎、宇根隆通、宮元敬天、西田 孝洋
  • Organizer: 日本薬剤学会第29年会
  • Place of Presentation: 大宮ソニックシティビル（さいたま市）
  • Year and Date: 2014-05-20 – 2014-05-22
• [Presentation] A rapid screening method utilizing dual macromolecular markers for development of therapeutic methods of peritoneal injury (2014)
  • Author(s): Shintaro Fumoto, Haruna Hirata, Hirotaka Miyamoto, Shigeru Kawakami, Koyo Nishida
  • Organizer: PSWC2014
  • Place of Presentation: Melbourne Convention and Exhibition Centre (Melbourne, Australia)
  • Year and Date: 2014-04-13 – 2014-04-16
• [Remarks] 薬剤学研究室（NUSP） HP
  • URL: http://www.ph.nagasaki-u.ac.jp/lab/dds/index-j.html