生命にやさしいワクチン品質管理法の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25350587
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 岩城 正昭 国立感染症研究所, その他部局等, 研究員 (20176530)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ワクチン / 生物製剤 / 品質管理 / 破傷風 / DPT

Outline of Annual Research Achievements

[目的]ワクチンなどの生物学的製剤は一般の医薬品とは異なり、「物理化学的手法だけではその安全性・有効性を評価できない(WHO)」ため、品質管理においては実験動物が用いられることが多い。特に破傷風ワクチン（破傷風トキソイド）の有効性を調べる力価試験においては、マウスにワクチンを投与（免疫）しておいてから人為的に毒素を投与（毒素攻撃）し、耐えるかどうかを指標にする試験法のため、動物に苦痛を強いている。動物福祉の観点から、より苦痛の少ない試験法の開発が望まれる。そこで本研究では、免疫によりマウスに付与された防御能を、毒素攻撃によらずにin vitroで測定できる手法の開発を目指す。
[方法]複数の段階から構成される破傷風毒素の作用のうち特定の段階に対して免疫マウスの抗体による阻害を測定することで防御能（ワクチン力価）を測定する。重要な２つの段階として (1)毒素の細胞への結合、(2)毒素による標的蛋白VAMP2の切断、を選び検討する。昨年度は(2)を中心に検討し、本年度は(1)の検討も行なった。
[結果と考察](2)については昨年度に引き続き、連携研究者が作成したVAMP2の一部分とタグの融合蛋白を基質として用い、破傷風毒素による基質の切断を検討した。検出方法として、昨年度のWestern blottingよりも多検体の処理が可能な系の構築をめざし、96穴固相に固定した基質蛋白から切断により遊離した断片を蛍光検出することを試みた。遊離した断片を検出することはできたが、検出感度の向上が課題である。(1)については、昨年同定されたレセプター分子nidogenの全長および毒素結合部位のペプチドを固相に固定し、破傷風毒素のレセプターへの結合を検出することができたが定量化と検出感度が課題となった。そのため今後は毒素とレポーター蛋白質の融合蛋白質の利用を検討する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

毒素の標的蛋白質切断活性の測定(2)について、２５年度に基礎を構築することができたので本年度は多検体処理可能な系の構築を目指したが、検出感度の面で十分な成績を得られておらず、感度向上が課題である。一方、受容体結合活性の測定(1)については、固相表面への毒素の非特異的結合などの問題を解決し十分な定量性と検出感度を得ることが課題となっている。

Strategy for Future Research Activity

標的蛋白質切断活性(2)の測定系については、多検体処理を可能にするための検討と並行して、複数種類の抗体による切断活性の阻害能の比較を定量的に行ない、in vivo力価試験の代替法として妥当かどうかの検討を行なう。また、受容体結合活性の測定系(1)については、測定時に生じる非特異的結合の影響を排除するための検討を行なってゆく。また、レポーター蛋白質と毒素の融合蛋白質を用いた結合活性測定系についても検討する予定である。一方で、(1)(2)のような抗体の中和活性ではなく抗体の毒素への結合活性をELISAなどにより測定し、in vivo力価試験との比較を行ない、代替法としての妥当性があるかどうかを検討することも行なう予定である。その上で、in vivo法の代替法として最適な評価系を提示することを目指す。

Causes of Carryover

年度末納品等にかかる支払いが平成２７年４月１日以降となったため、
当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。
平成26年度分についてはほぼ使用済みである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記のとおり。