アルツハイマー病に関与するカルパインの生体内基質・阻害剤の探索と動態解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25350917
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 津吹 聡 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 専門職研究員 (20217368)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: アルツハイマー病 / カルパイン / カルパスタチン / 二次元電気泳動 / タンパク質同定 / 質量分析 / 遺伝子改変マウス / 初代培養細胞

Outline of Annual Research Achievements

タンパク質分解酵素であるカルパインは生体内で重要な働きをしているが、異常に活性化するとアルツハイマー病(AD)をはじめ様々な病気を発症させる。異常活性化したカルパインの生体内基質を同定できればカルパインが関与する病気の予防や治療に結びつく端緒となる。生体内のカルパイン活性は、内在性特異的阻害剤であるカルパスタチンによって制御されているので、カルパスタチン遺伝子を破壊させてカルパインの活性制御を消失させたマウスと野生型マウスの海馬の初代培養細胞を使用して、異常活性化したカルパインの生体内基質の同定を試みた。海馬は記憶に関与し、ADにおいては多大な損傷を受ける部位であり、初代培養細胞は生体から採取されてあまり時間がたっていないことから、生体と同様な挙動を示すことが期待されるので実験に使用した。神経伝達物質であるグルタミン酸を添加後0分、60分の細胞を回収し、細胞質画分、膜・オルガネラ画分、核画分、細胞骨格マトリックス画分の4つに分画した。グルタミン酸刺激により、哺乳動物脳内ではシナプス伝達や記憶形成に関与するグルタミン酸受容体が活性化し、カルシウムイオンの流入が起こり、カルパインが活性化する。タンパク質以外の物質を除去後、ラベリング用液に溶解し、タンパク定量後、各画分を蛍光試薬でラベルし、二次元電気泳動を行った。比較する試料を異なる蛍光試薬でラベルし、混合した後電気泳動を行うこの方法を用いると1枚のゲル上で各試料中に含まれるタンパク質同士を比較することができた。カルパスタチン遺伝子欠損マウスと野生型マウス間およびグルタミン酸添加の有無での各画分のタンパク質スポットを蛍光検出システムにて比較・解析した。その後、銀染色が可能な量まで増やしたサンプルを調製し二次元電気泳動後、変動したタンパク質スポットをゲルから切り出し、酵素消化後、質量分析によりタンパク質同定を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

一連の実験手法を確立し、カルパスタチン遺伝子欠損マウスと野生型マウス間およびグルタミン酸添加の有無での4つの画分の量的に変化するタンパク質スポットの質量分析機を用いた同定が順調に進行中である。

Strategy for Future Research Activity

高速液体クロマトグラフィー質量分析法により解析し、タンパク質データベース（MASCOT）を利用して同定した量的に変動するタンパク質の特異的抗体を使用してさらに検定する。同定したタンパク質をカルパインで消化し、HPLCにより切断部位を決定し、切断部位特異的認識抗体を作製する。作製した切断部位特異的認識抗体を使用してカルパインの異常活性化の動態解析を行う。さらに得られた基質切断部位の情報から阻害剤の合成を検討する。