2014 Fiscal Year Research-status Report
転写活性欠失型ヒストン転写因子がもつ分子特性の解明
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25350969
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
高山 優子 帝京大学, 理工学部, 講師 (90461467)
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2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ヒストン / zinc finger / 分裂酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストン転写因子Ams2 のZinc fingerはヒストンプロモーター結合に必須な領域で、Zinc finger変異型Ams2はヒストン転写を活性化することができない。予備的な実験から、このZinc finger変異型Ams2は、タンパク質分解抵抗性とCENP-A機能阻害というユニークな特徴を示すことを見いだした。昨年度までに、タンパク質分解抵抗性の原因を特定できた。本年度は以下の解析を行った。
１、Ams2のZinc finger変異体（Ams2-Z）に別のZinc fingerを付加したキメラの作成
昨年度から引き続き、Zinc finger motifキメラAms2の作成を行った。キメラAms2タンパク質が期待通りに目的DNA配列に結合しているかを、クロマチン免疫沈降法(ChIP)解析により確認した。１コピーの配列ではキメラAms2タンパク質が結合しないため（昨年度結果）、本年度はさらにコピー数を増やすことにした。目的DNA配列を2,4,6とコピー数の増加を試みたが、コンストラクトを得ることができなかった。
２、CENP-A機能阻害を起こすメカニズムの解明 (1)Ams2のZinc finger変異体（Ams2-Z）をcnp1温度感受性変異株に過剰発現すると細胞死を引き起こす。そこで、deletion mutant を作製して、細胞死を引き起こす領域の特定を行った。すると、N末端領域のみの過剰発現で細胞死を引き起こすことがわかった。(2)Ams2のN末端領域の機能について出芽酵母ヒストン転写因子は２量体を形成することから、Ams2が２量体形成するかをyeast two hybrid法により確認した。すると、N末端領域で相互作用することがわかった。(3)Ams2のZinc finger変異体（Ams2-Z）におけるヒストン転写量の解析 Zinc fingerはDNA結合モチーフであるため、ヒストンプロモーターに結合せず、ヒストンの転写を活性化しないことが予想される。そこで、ヒストン転写量の定量をRT-PCRによりを行った。Ｓ期に同調したAms2-Zではヒストン転写量の減少がみられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画書に示した以下の計画について、以下のように順調に進んでいる。
１、Ams2のZinc finger変異体（Ams2-Z）はCENP-A転写量を減少させる？
Ams2-Zの過剰発現によりCENP-Aの転写量に変化はなかったが、ヒストン転写量の減少が確認された。また、ams2遺伝子破壊とcnp1温度感受性変異の２重変異は細胞生育できないことから、Ams2-Zによるヒストン転写量の減少がCENP-A機能阻害を引き起こしていると考えられる。
２、Ams2-ZはCENP-Aと直接的に結合する？
Ams2とCENP-Aとの直接的な相互作用は共免疫沈降法などで調べたが、現在までにpositiveな結果は得られていない。一方、Yeast two hybrid法により、Ams2同士が相互作用する結果が得られた。さらに、N末側またはＣ末側から欠失させたdeletion mutant を作製してyeast two hybrid解析を行った。すると、Ams2同士が相互作用する最少断片を特定することができた。この相互作用領域を欠失させると、CENP-A機能阻害効果が消失することも明らかとなった。これらの結果は、Ams2同士の相互作用がCENP-A機能と密接に関連していることを示している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２７年度は、Ams2-ZのCENP-A機能阻害について以下の実験を行う。
１、Ams2-Z変異の過剰発現による、ヒストン転写量の減少について
Ams2-Z過剰変異によりヒストン転写量が減少する原因には、①Ams2-Zがヒストン転写を阻害している ②ヒストンmRNAの安定性を低下させている という２つの可能性が考えられる。はじめに、Ams2-Z過剰発現株において、Ams2-Zと染色体上のAms2がヒストンプロモーターに結合しているのかどうかを、クロマチン免疫法により確認する。Ams2-Zの過剰発現により、染色体由来Ams2のヒストンプロモーター結合の減弱が起こっているのであれば、①の可能性が高いと判断する。②の可能性は、Ams2-Z過剰発現株をシクロヘキシミド処理し、各時間に細胞を回収してヒストンmRNA量をNorthern blotまたはRT-PCRにより確認する。
２、Ams2同士の相互作用について
Ams2相互作用について生化学的に解析する。大腸菌発現系を用いて、精製Ams2タンパク質を得て、ゲル濾過カラム分離を行う。これにより、Ams2が二量体化それともそれ以上の複合体であるのかが、明らかにできる。しかし、Ams2は単量体で見かけ100 kDaにもなるため、分離が難しいかもしれない。そこで、N末端側のみの組換えタンパク質での解析も行う。すでに、Ams2発現ベクターは作成済みである。また、大腸菌発現によるタンパク質精製がうまく働かない時には、バキュロウイルス感染系で検討する。 ３、これまでの結果をまとめ、論文投稿を目指す。
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| Causes of Carryover |
消耗品で計上していたReal-Time PCR試薬やディスポーザブル用品についてはキャンペーン時にまとめて購入したために、次年度に使用額（１万２千円程度）が生じることとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の研究費使用計画は、転写量の測定やクロマチン免疫沈降に用いるReal-Time PCR試薬や抗体、免疫沈降用ビーズ等が必要となる。さらに、Northern blotには、RNA調製試薬や核酸転写膜、ラジオアイソトープなどが必要である。組換えタンパク発現においては、培養のための培地・フラスコや発現誘導物質、精製過程では、プロテアーゼ阻害剤やタグ付きビーズ等が必要である。ゲル濾過カラムのフラクションには、ゲル濾過カラムや充填剤、フラクションチューブやコントロールマーカー等も必要になる。実験全般にわたって分裂酵母を使用するので、酵母培養培地・抗生物質・シャーレ・アミノ酸類が必要である。本研究の進捗状況を発表し、幅広い分野の方々からご助言をいただくことが本研究推進にとって必須であるため、分子生物学会などの学会参加に伴う旅費も計上する。また、論文投稿を目指すため、英文校正費や論文投稿料なども計上する。
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