タンパク質に隠された新しい生理活性ペプチド「クリプタイド」の探索と生理機能の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25350971
• Research Institution: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• Principal Investigator: 向井 秀仁 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (20251027)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木曽 良明 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 客員教授 (40089107)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: クリプタイド / マイトクリプタイド / 生理活性ペプチド / Gタンパク質共役受容体 / 好中球 / 自然炎症 / 中和抗体 / 拮抗阻害ペプチド

Outline of Annual Research Achievements

我々は最近、ミトコンドリアタンパク質由来の好中球を活性化する３種類の新しい生理活性ペプチド、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-CYCを生体組織より単離・精製することで同定した。さらに、ミトコンドリアタンパク質由来の断片ペプチドの中に、新規好中球活性化ペプチドが多数存在しており、好中球の挙動はこれら多数の活性化ペプチドによって制御されている可能性があることを明らかにした。そこで本研究は、さらに新規クリプタイドを同定すること、それらの情報伝達機構および生理的存在意義と病態との関わりを解明することを目的としている。本年度の検討により、以下の研究成果が得られた。
１）マイトクリプタイド情報伝達機構の解析：マイトクリプタイドとそれらの受容体との相互作用の構造的特徴を明らかにするため、マイトクリプタイドによる好中球活性化におけるペプチド構造と活性との相関を検討した。その結果、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2および新たに同定したマイトクリプタイド-3において、それらペプチドが好中球を活性化する最小ペプチド構造単位および最大内活性を示すペプチド配列を明らかにするとともに、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-3の活性を拮抗的に阻害する複数のアンタゴニスト開発に成功した。
２）マイトクリプタイドの生理的機能の解析：マイトクリプタイドの生理的機能を解析するため、既に単離・同定しているマイトクリプタイドに対するモノクローナル抗体の作製を試みた。その結果、エピトープの異なる複数のマイトクリプタイド-1およびマイトクリプタイド-2に対する特異的モノクローナル抗体の取得に成功するとともに、複数種のマイトクリプタイド-1およびマイトクリプタイド-2に対する特異的中和抗体およびそれぞれの親タンパク質からの切断点を認識する抗体の取得に成功した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

我々は最近、ミトコンドリアタンパク質に隠された好中球を活性化する３種類の新しい生理活性ペプチド、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-CYCを同定した。さらに世界に先駆けて、ミトコンドリアタンパク質配列の中に、好中球活性化能を持つペプチド配列が存在していることを示唆し、このような元のタンパク質と全く異なった生体機能を持つ断片ペプチドを総称してクリプタイドと命名している。このような研究背景を踏まえ本研究は、さらに新規クリプタイドを同定すること、それらの情報伝達機構および生理的存在意義と病態との関わりを解明することを目的としている。本年度はマイトクリプタイドとそれらの受容体との相互作用の構造的特徴を明らかにするため、マイトクリプタイドによる好中球活性化におけるペプチド構造と活性との相関を検討し、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2および新たに同定したマイトクリプタイド-3において、好中球活性化における最小ペプチド構造単位および最大内活性を示すペプチド構造を明らかにすることができた。さらにマイトクリプタイドの生理的機能を明らかにするため、それらに対する特異的モノクローナル抗体の調製を試み、マイトクリプタイド-1およびマイトクリプタイド-2に対する複数種の特異的認識抗体の取得に成功し、概ね予定通りに研究が進捗した。また本年度、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-3による好中球活性化において、それらを特異的に拮抗阻害するペプチド誘導体のデザイン・合成に成功、さらにマイトクリプタイド-1およびマイトクリプタイド-2に対する特異的中和抗体の取得にも成功し、マイトクリプタイドの生理機能を解析する上で非常に有用な武器を得ることができた。このような拮抗阻害ペプチドや特異的中和抗体を得ることは難しく、予想を超える成果をあげられた。

Strategy for Future Research Activity

本研究は、我々が発見したミトコンドリアタンパク質に隠された一群の好中球活性化クリプタイド、マイトクリプタイドの情報伝達機構および生理的存在意義と病態との関わりを解明すること、またさらに新規クリプタイドを探索・同定することを目的としている。
本年度、マイトクリプタイドによる好中球活性化におけるペプチド構造と活性との相関を検討した結果、マイトクリプタイド-1、マイトクリプタイド-2ならびにマイトクリプタイド-3による活性化における最小ペプチド構造単位および最大内活性を示すペプチド構造を明らかにすることができた。これらの情報は、マイトクリプタイド受容体同定を効率的に行うことのできるプローブペプチドのデザインに重要な知見を与えるもので、実際、受容体を効率的に同定し得るプローブペプチドのデザインにも見通しがついてきた。今後はマイトクリプタイドの受容体同定を、これらプローブペプチドと受容体を架橋することにより試みてゆく予定である。また上述したように本年度、構造活性相関を検討することにより、マイトクリプタイド-2およびマイトクリプタイド-3に対する拮抗阻害ペプチドのデザイン・合成に成功しているが、今後は拮抗阻害活性がより強く、酵素耐性のある拮抗阻害ペプチドをデザイン・合成してゆく予定である。さらに、取得した特異的抗体を用いて、それらのマイトクリプタイドの存在分子形態、生合成、分布および産生を検討するとともに、取得した中和抗体や拮抗阻害ペプチドによる生物活性阻害作用を用いて、個体レベルでマイトクリプタイドの生理機能および病態との関わりを解析してゆく予定である。加えて、未だ特異的抗体を取得していない様々なマイトクリプタイドに対する特異的モノクローナル抗体の調製も試みるとともに、さらに新たなマイトクリプタイドの同定も試みてゆく予定である。

Research Products

• [Journal Article] Successful acquisition of a neutralizing monoclonal antibody against a novel neutrophil-activating peptide, mitocryptide-1 (2015)
  • Author(s): Hattori, T., Nakashima, K., Marutani, T., Kiso, Y., Nishi, Y., and Hidehito Mukai, H.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: in press Pages: in press
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Mitocryptides: Elucidation of their biological functions with their monoclonal antibodies (2014)
  • Author(s): Hattori, T., Araki, R., Nakashima, K., Marutani, T., Ogino, S., Koike, Y., Hirooka, Y., Miyake, N., Murata, K., Watanabe, K., Kiso, Y., Nishi, Y., and Mukai, H.
  • Journal Title: Peptide Science Volume: 2013 Pages: 247-248
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Endogenous N-formylated cryptides: Investigation of their biological functions (2014)
  • Author(s): Marutani, T., Hattori, T., Koike, Y., Harada, A., Watanabe, K., Kiso, Y., and Mukai, H.
  • Journal Title: Peptide Science Volume: 2013 Pages: 249-250
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Aggregation inhibitor of amyloid-β peptide based on O-acyl isopeptide (2014)
  • Author(s): Kawashima, H., Sohma, Y., Nakanishi, T., Kitamura, H., Mukai, H., Yamashita, M., Akaji, K., and Kiso, Y.
  • Journal Title: Peptide Science Volume: 2013 Pages: 101-104
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] クリプタイドータンパク質に隠された新しい生理活性ペプチド (2014)
  • Author(s): 服部竜弥，向井秀仁
  • Journal Title: 日本薬理学雑誌 Volume: 144 Pages: 234-238
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Cryptides and their accumulative signaling mechanisms for novel therapeutic targets (2015)
  • Author(s): Mukai, H.
  • Organizer: 7th Annual AisiaTIDES
  • Place of Presentation: Osaka
  • Year and Date: 2015-03-03 – 2015-03-05
  • Invited
• [Presentation] マイトクリプタイド-3の好中球様細胞活性化における構造活性相関の検討 (2014)
  • Author(s): 中島健太、丸谷飛之、服部竜弥、野口公輔、木曽良明、向井秀仁
  • Organizer: 第51回ペプチド討論会
  • Place of Presentation: 徳島
  • Year and Date: 2014-10-22 – 2014-10-24
• [Presentation] マイトクリプタイド-1受容体のリガンド認識機構の検討 (2014)
  • Author(s): 堤光己、丸谷飛之、服部竜弥、木曽良明、向井秀仁
  • Organizer: 第51回ペプチド討論会
  • Place of Presentation: 徳島
  • Year and Date: 2014-10-22 – 2014-10-24
• [Presentation] 好中球活性化ペプチド、マイトクリプタイド-1に対する中和抗体の取得とそれを用いた生理機能解析 (2014)
  • Author(s): 服部竜弥、荒木良太、福井茜音、中島健太、丸谷飛之、木曽良明、西義介、向井秀仁
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [Presentation] 新規の内因性ホルミルペプチドによる好中球活性化機序 (2014)
  • Author(s): 丸谷飛之、堤光己、服部竜弥、小池裕介、原田明彦、渡辺建佑、野口公輔、山中陽介、木曽良明、向井秀仁
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [Presentation] 一群の新規好中球活性化ペプチド、マイトクリプタイドに対する受容体のリガンド認識機構の解明 (2014)
  • Author(s): 中島健太、丸谷飛之、服部竜弥、青木慎一郎、梅田龍平、仁本義章、野口公輔、福井茜音、山中陽介、木曽良明、向井秀仁
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [Presentation] Mitocryptides: Physiological Significance of a Novel Family of Neutrophil-Activating Peptides (2014)
  • Author(s): Mukai, H., Hattori, T., Marutani, T., Nakashima, K., Tsutsumi, K., and Kiso, Y.
  • Organizer: 15th German-Japanese Symposium on Peptide Science
  • Place of Presentation: Boppard, Germany
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-09
  • Invited
• [Presentation] Mitocryptide-2: structure-activity relationships for the elucidation of ligand recognition mechanisms of Formyl-peptide receptor like-1 (2014)
  • Author(s): Marutani, T., Hattori, T., Koike, Y., Harada, A., Watanabe, K., Kiso, Y., and Mukai, H.
  • Organizer: 33rd European Peptide Symposium
  • Place of Presentation: Sofia, Bulgaria
  • Year and Date: 2014-08-31 – 2014-09-05
  • Invited
• [Presentation] Functional analysis of mitocryptides with their neutralizing monoclonal antibodies (2014)
  • Author(s): Hattori, T., Araki, R., Watanabe, K., Marutani, T., Nakashima, K., Nishi, Y., Kiso, Y., and Mukai, H.
  • Organizer: 33rd European Peptide Symposium
  • Place of Presentation: Sofia, Bulgaria
  • Year and Date: 2014-08-31 – 2014-09-05
• [Presentation] 一群の新規好中球活性化ペプチド、マイトクリプタイドに対する特異的抗体を用いた生体機能解析 (2014)
  • Author(s): 服部竜弥、荒木良太、渡辺建佑、丸谷飛之、中島健太、西義介、木曽良明、向井秀仁
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会 第9回年会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2014-06-11 – 2014-06-13
• [Presentation] ミトコンドリアタンパク質に由来する内因性N-ホルミル化クリプタイドの生体機能解析 (2014)
  • Author(s): 丸谷飛之、服部竜弥、小池祐介、原田明彦、渡辺建佑、堤光己、野口公輔、木曽良明、向井秀仁
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第9回年会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2014-06-11 – 2014-06-13
• [Remarks] 長浜バイオ大学ペプチド科学研究室
  • URL: http://b-lab.nagahama-i-bio.ac.jp/~h_mukai/
• [Remarks] 長浜バイオ大学教員紹介
  • URL: http://www.nagahama-i-bio.ac.jp/research/