レスベラトロールのアザ誘導体化合物による細胞増殖抑制機構の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25350979
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 藤田 至彦 近畿大学, 医学部, 助教 (80192730)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: レスベラトロール / MIF / NFkB / JNK

Research Abstract

レスベラトロールのアザ誘導体(ARVD)の細胞毒性に対するMIFの保護作用（アポトーシス回避機構）を評価するために、ARVDに感受性をもつMCF7および非感受性であるA549の２細胞株にi. MIFのcDNA、ii. MIFのshRNAの発現誘導ベクターをそれぞれ導入した。MIFの過剰発現（上記i）によるARVDに対する感受性の変化は両細胞株とも見られなかったが、癌細胞株にはもともと正常細胞と比べてMIFが過剰発現していることから、MIFの強制発現による上乗せ効果は見込まれないと考えられた。一方、MIFのノックダウン（上記ii）によるARVD感受性の亢進がA549細胞で見られたことから、MIFはARVDの（活性酸素による）細 胞毒性から細胞を保護する作用を有するという仮説が裏付けられた。
上記MIFの保護作用における機序の第一段階として、MIFがNFkBを活性化する経路が有力だが、これを証明するために、ARVDの添加後にNFkBの下流にあるアポトーシス誘導性キナーゼ（JNK）のリン酸化をウェスタンブロッティングで解析した。この場合、リン酸化の消失がJNKの不活性化（およびNFkBの活性化）の指標となる。コントロールおよびMIFをノックダウンしたA549株にARVDを添加すると、前者よりも後者のほうが、リン酸化の亢進を認めた。すなわち、ノックダウン株ではMIFの発現低下にともない、NFkBの活性化が弱まり、その結果JNKの抑制が起こらず、細胞にアポトーシスを誘導することが考えられた。
新規誘導体として、細胞に活性酸素を生成しやすくする水酸基（還元力）を増やしたもの、－OHを－OMeに変えて疎水性すなわち細胞膜透過性を高めたもの、MIFとの親和性を生じさせた構造的要因となるレスベラトロール骨格におけるC=Nの位置を入れ替えたもの、など数化合物を合成した（連携研究者担当）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

３年間の研究計画として以下の事項を示している。１． MIFのアポトーシスからの回避機構についての解析
a. MIFによるROSからの細胞保護作用（アポトーシス回避機構）の評価。b. MIFによるJNKの不活性化の評価。c. MIFによるJNKの不活性化の経路についての検討。d. ROSがMIFをup-regulateする可能性の検討。e. RVのアザ誘導体による増殖抑制効果のmode of actionに関わる遺伝子群を探索する。
２．MIFとのドッキングによる新規レスベラトロール誘導体の創製および細胞毒性の評価
a. 新規レスベラトロール誘導体のデザイン。b. 新規レスベラトロール誘導体のアッセイおよび最適化。
これらのうち、1-aおよびb、2-aは終了しており、１年分のペース配分としておおむね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

「現在までの達成度」で示した未遂行項目のうち、２年目は1-c, 1-d, 2-bを行う予定である。1-cでは、ARVDの添加後に、NFkBのDNA結合能をゲルシフトアッセイ法で評価し、MIF発現（ノックダウン）の有無により、NFkBの転写活性がどのように変化するか調べる。これによりMIFとNFkBがリンクしているかどうか推定可能である。1-dでは、MCF7細胞にARVDを添加したのち、培地中へのMIFの分泌量をElisaで、MIFのmRNAの変化をリアルタイムPCRで測定し、ROSがMIFをup-regulateする可能性を検討する。
2-bでは、新規誘導体化合物を１）細胞に添加し、細胞増殖抑制の濃度依存性をMTT法で測定、２）MIFに対する結合能を、MIFのもつ酵素反応（ドーパクロムメチルエステルの異性化反応）に対する阻害活性にて評価を行うことにより、低濃度におけるがん細胞増殖抑制および正常細胞への低毒性の実現に向けて化合物の最適化を図る。

Research Products

• [Journal Article] Melanoma transition is frequently accompanied by a loss of cytoglobin expression in melanocytes: a novel expression site of cytoglobin. (2014)
  • Author(s): Fujita Y, Koinuma S, De Velasco MA, Bolz J, Togashi Y, Terashima M, Hayashi H, Matsuo T, Nishio K.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 9 Pages: 1-9
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0094772.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The OCT4 pseudogene POU5F1B is amplified and promotes an aggressive phenotype in gastric cancer. (2014)
  • Author(s): Hayashi H, Arao T, Togashi Y, Kato H, Fujita Y, De Velasco MA, Kimura H, Matsumoto K, Tanaka K, Okamoto I, Ito A, Yamada Y, Nakagawa K, Nishio K.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1038/onc.2013.547.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Gene amplification of EGFR, HER2, FGFR2 and MET in esophageal squamous cell carcinoma. (2013)
  • Author(s): Kato H, Arao T, Matsumoto K, Fujita Y, Kimura H, Hayashi H, Nishiki K, Iwama M, Shiraishi O, Yasuda A, Shinkai M, Imano M, Imamoto H, Yasuda T, Okuno K, Shiozaki H, Nishio K.
  • Journal Title: Int J Oncol Volume: 42 Pages: 1151-1158
  • DOI: 10.3892/ijo.2013.1830.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Slug increases sensitivity to tubulin-binding agents via the downregulation of βIII and βIVa-tubulin in lung cancer cells. (2013)
  • Author(s): Tamura D, Arao T, Nagai T, Kaneda H, Aomatsu K, Fujita Y, Matsumoto K, De Velasco MA, Kato H, Hayashi H, Yoshida S, Kimura H, Maniwa Y, Nishio W, Sakai Y, Ohbayashi C, Kotani Y, Nishimura Y, Nishio K.
  • Journal Title: Cancer Med Volume: 2 Pages: 144-１54
  • DOI: 10.1002/cam4.68
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A microarray-based gene expression analysis to identify diagnostic biomarkers for unknown primary cancer. (2013)
  • Author(s): Kurahashi I, Fujita Y, Arao T, Kurata T, Koh Y, Sakai K, Matsumoto K, Tanioka M, Takeda K, Takiguchi Y, Yamamoto N, Tsuya A, Matsubara N, Mukai H, Minami H, Chayahara N, Yamanaka Y, Miwa K, Takahashi S, Takahashi S, Nakagawa K, Nishio K.
  • Journal Title: PLoS One Volume: ８ Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0063249.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Detection of epidermal growth factor receptor T790M mutation in plasma DNA from patients refractory to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor. (2013)
  • Author(s): Sakai K, Horiike A, Irwin DL, Kudo K, Fujita Y, Tanimoto A, Sakatani T, Saito R, Kaburaki K, Yanagitani N, Ohyanagi F, Nishio M, Nishio K.
  • Journal Title: Cancer Sci Volume: 104 Pages: 1198-1204
  • DOI: 10.1111/cas.12211.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Influence of novel supramolecular substance, [2] rotaxane, on the caspase signaling pathway in melanoma and colon cancer cells in vitro. (2013)
  • Author(s): Hara K, Beppu T, Kimura M, Fujita Y, Takata T, Nishio K, Ono N.
  • Journal Title: J Pharmacol Sci Volume: 122 Pages: 153-157
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel single nucleotide polymorphism markers for low dose aspirin-associated small bowel bleeding. (2013)
  • Author(s): Shiotani A, Murao T, Fujita Y, Fujimura Y, Sakakibara T, Nishio K, Haruma K.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 8 Pages: ー
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0084244.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Overexpression of heparan sulfate 6-O-sulfotransferase-2 in colorectal cancer. (2013)
  • Author(s): Hatabe S, Kimura H, Arao T, Kato H, Hayashi H, Nagai T, Matsumoto K, DE Velasco M, Fujita Y, Yamanouchi G, Fukushima M, Yamada Y, Ito A, Okuno K, Nishio K.
  • Journal Title: Mol Clin Oncol Volume: １ Pages: 845-850
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 上皮成長因子受容体遺伝子異常と肺発癌 (2013)
  • Author(s): 藤田至彦、西尾和人
  • Journal Title: 日本臨床増刊号 最新肺癌学 Volume: 増刊 Pages: 135－139
• [Presentation] A microarray-based gene expression analysis identified diagnostic biomarkers for unknown primary cancer (2014)
  • Author(s): Yoshihiko Fujita, Issei Kurahashi, Takayasu Kurata, Yasuhiro Koh, Kazuko Sakai, Kazuhiko Nakagawa, Kazuto Nishio
  • Organizer: 米国癌学会年会（AACR)
  • Place of Presentation: 米国サンディエゴ市コンベンションセンター
  • Year and Date: 20140405-20140409
• [Presentation] Optimization of multiplex mutation analysis based on minimum amount of lung cancer specimen (2013)
  • Author(s): 冨田秀太、坂井和子、藤田至彦、寺嶋雅人、富樫庸介、デベラスコマルコ、光冨徹哉、中川和彦、西尾和人
  • Organizer: 日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 20131003-20131005
• [Presentation] A Microarray-Based Gene Expression Analysis Identified Diagnostic Biomarkers for Unknown Primary Cancer (2013)
  • Author(s): Yoshihiko Fujita, Issei Kurahashi, Takayasu Kurata, Yasuhiro Koh, Kazuko Sakai, Kazuhiko Nakagawa, Kazuto Nishio
  • Organizer: 欧州がん治療学会（ＥＳＭＯ）
  • Place of Presentation: オランダ、アムステルダム、RAI・コンベンションセンター
  • Year and Date: 20130927-20131001