生物発光共鳴エネルギー移動機構を利用した低分子化合物の光イメージング法の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25350983
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 呉 純 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (90415646)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 発光プローブ / ペプチド / ファージ / アデノシン三リン酸 / 生物発光共鳴エネルギー移動 / ルシフェラーゼ / 蛍光タンパク質 / スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、生物発光エネルギー移動機構に基づく低分子化合物の発光プローブの創製を目指す。昨年度では、低分子化合物であるS-アデノシル-L-ホモシステイン（SAH)の2級アミノ基を介して固相化し、ファージディスプレイ技術を用いてSAHに結合する複数のファージクローンを得た。本年度は、得られた複数のクローンからアデノシン骨格に結合するペプチドを決定するために、同じアデノシン骨格を有するアデノシン三リン酸（ATP)のリン酸基を介してマグネットビーズに固相化し、同様にファージディスプレイの手法でファージクローンのスクリーニングを行った。その結果、アミノ酸配列CRGATPMSCを持つペプチドが得られた。このペプチドは昨年度のSAHに対するスクリーニングの際にも得られていたので、このペプチドはアデノシン骨格に結合することが強く示唆された。一方、ATPのリン酸部分に結合するペプチドを得るため化合物8-Azidoadenosine-5'triphosphate(ATP誘導体)をクリック反応でアデノシンの部分を介してビオチン官能基を導入し、ストレプットアビジンカラムにて固相化した。それから、ファージディスプレイの手法で結合するファージクローンのスクリーニングを行った。その結果、塩基性ペプチドSDVHRNAIKSTMが得られた。単離された上記2種類ファージクローンは抗M13抗体HRPによって固相したATPに対して陽性であることを確認した。現在、この2種類ペプチドをルシフェラーゼや蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いて、ATPに対する親和性の確認作業を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究は、低分子化合物を可視化する新規の生物発光プローブの創製を目指すものである。具体的には、低分子化合物を挟むニ種類のペプチドをスクリーニングし、得られたペプチドをルシフェラーゼや蛍光タンパク質に融合させることによって、生物発光エネルギー移動機構に基づく低分子化合物を検出する発光プローブの創製を計画していた。本年度では、低分子化合物であるアデノシン三リン酸（ATP)の両側のリン酸基やアデノシル基を介してそれぞれ固相化し、ファージディスプレイ技術を用いてATPに結合する２つのペプチド配列を得ることに成功した。次に、これらのペプチド配列をオーバーラップエクステンションPCR法でルシフェラーゼや蛍光タンパク質の上流に融合させて、無細胞翻訳発現系を用いた融合タンパク質の転写と翻訳を行った。現在、得られた融合タンパク質はATPのビーズに対する親和性の確認の実験を行っている。一方、ペプチドをルシフェラーゼや蛍光タンパク質への融合する場所が作成される融合タンパク質としてのルシフェラーゼや蛍光タンパク質の発光・蛍光活性に対して影響を及ぼすので、2種類の融合タンパク質の配列の挿入位置についてさらなる検討が必要です。その作業は予想以上に時間が掛かった。そのため、当初の計画にあった生物発光エネルギー移動機構に基づく低分子化合物であるATPの検出までにはまだ至っていない。次年度以降に検討を行う予定ことになった。

Strategy for Future Research Activity

今年度はファージディスプレイ技術を用いてATPに結合する２つのペプチド配列が得られたので、次年度以降の予定としては、まずルシフェラーゼや蛍光タンパク質との融合タンパク質の作製の最適化と融合タンパク質のATPに対する親和性の確認作業を加速させる。次に、2つの融合タンパク質がATPの存在下で分子間の生物発光共鳴エネルギーの移動の有無を測定する。それから、融合発光タンパク質や蛍光タンパク質のそれぞれの濃度を変化させて、ATPの濃度に依存する生物発光共鳴エネルギー移動のシグナルの変化について発光ルミノメーターを用いて調べる。さらに、生物発光共鳴エネルギー移動を観測する発光測定装置のバンドパスやロングパスフィルターの選定についても検討する。一方、より優れる一分子内の生物発光共鳴エネルギーに基づく発光プローブの創製についても検討する。具体的には、すでに得られた２つのペプチドのDNA配列断片の間に50mer以下のランダム合成オリゴヌクレオチドを繋ぎ、T7ファージDNAベクターに組み込んで大腸菌に感染させることによって得られるファージライブラリーを用いて、すでに固相化したATPに対して再度スクリーニングを行い、より親和性の高い一分子タイプのペプチド配列の探索を行う。それから、同定されたペプチドの配列の両端にルシフェラーゼや蛍光タンパク質を繋ぐことによって、分子内の発光ローブの生物発光エネルギー移動機構の構築を試みると同時にその挙動を観測する。

Causes of Carryover

前年度の未使用額として4934円が残った。その分は試薬の購入に充てる予定だったが、年度末の会計手続きの締め切りに間に合わず、発注することができなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

前年度の未使用分は試薬の購入に充てる予定だったが、会計手続きの締め切りに間に合わず、発注することができなかったので、今年度中に試薬の購入に充てる予定である。