分子進化工学的手法によるカルシウムチャネルサブファミリーを識別するペプチドの創製

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25350984
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 木村 忠史 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (60344214)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保 泰 独立行政法人産業技術総合研究所, 創薬分子プロファイリング研究センター, 副センター長 (10178030) ; 亀山 仁彦 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (50224697)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: PERISS法 / パッチクランプ / 大腸菌 / パドルキメラ

Research Abstract

本年度は、Cav3.1, Cav3.2, Cav3.3の電位センサーパドルを用いたパドルキメラチャネルの作製を行い、一部のキメラの作製が済んでいる。一方、キメラのベースとなるヒトKv2.1が大腸菌内膜で機能的に発現しているかどうかを大腸菌を用いたパッチクランプ法にて電流測定を行い検討した。その結果、大腸菌パッチクランプ法で大腸菌内膜に発現させたヒトKv2.1の電流を測定することができた。また、更にヒトKv2.1とその阻害ペプチドであるHanatoxin 1をモデルとしてPERISS法を実施し、キメラのベースとなるヒトKv2.1でPERISS法が機能的に実施可能であることを証明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度はCav3.1, Cav3.2, Cav3.3の電位センサーパドルを用いたパドルキメラチャネルを作製しその活性を測定する予定であったが、パドルキメラの作製は一部にとどめた。一方で、パドルキメラ作製の大前提となる大腸菌内膜でKv2.1が機能的に発現しているかどうかを大腸菌パッチクランプ法で検討し、内膜上のKv2.1電流が測定できたこと、更にヒトKv2.1とHanatoxin 1をモデルとしてPERISS法が機能することを証明できたことから順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

来年度は、パドルキメラの作製を継続しつつ、大腸菌パッチクランプ法でその活性を測定できるか検討するとともに、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的手法でその活性を測定する。また、GTx1-15を鋳型として加速進化型ペプチドライブラリーを作製し、一部のパドルキメラを用いてPERISS法を実施する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

今年度は大腸菌パッチクランプおよびヒトKv2.1-Hanatoxin1をモデルとしたPERISS法を主に実施したため、パドルキメラ作製およびアフリカツメガエルを用いた電気生理実験を次年度に実施することとしたため。
パドルキメラ作製用オリゴの発注と作製に必要な酵素等の購入費用とする。また、アフリカツメガエルを用いた電気生理実験に必要な機器を更新する必要が出てきたので、それらの機器購入費用とする。