2013 Fiscal Year Research-status Report
単結晶ナノ粒子生成容器としてのタンパク質構造の最適化
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25390020
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Meiji University |
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Principal Investigator |
吉村 英恭 明治大学, 理工学部, 教授 (70281441)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | フェリチン / ナノ粒子 / 単結晶 / フェライト |
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| Research Abstract |
この研究課題では中空構造のタンパク質フェリチンの空洞中に無機物の結晶を成長させて大きさがそろったナノ粒子を作り、かつナノ粒子の結晶構造を制御することを目的としている。研究計画では初年度はフェライトのナノ粒子の結晶構造を制御することから始めることになっており、24量体で構成されているサブユニットの一部に鉄酸化活性部位を持つサブユニットに置き換えることを試みた。
1.鉄酸化活性部位のないLサブユニットにHサブユニットにみられる酸化活性部位を導入した。LフェリチンのY24およびK59をグルタミン酸に、G62をヒスチジンに変えて鉄酸化活性部位を導入を試みた。Y24E, K59E, G62H, Y24E+K59E, K59E+G62H, Y24E+K59E+G62HをサブユニットとするLフェリチンを作った。このうちK59Eを含むものはすべて不溶画分に入ってしまった。Y24EおよびG62Hは生成できたが、鉄の酸化速度は野生株とほとんど同じであった。
2.ウマのHフェリチンのアミノ酸配列は知られていたが、遺伝子は手持ちがなかったので、合成により作成した。プラスミドに組み込み大腸菌で発現させることはできたが、イオン交換クロマトグラム流出のフェリチン画分が通常単一ピークになるところが２つのピークとなった。鉄の酸化速度を計測したところ、どちらの画分もLフェリチンと比べて２桁以上早く鉄を酸化することがわかった。しかし、反応後タンパク質の沈殿がLフェリチンに比べて多く見られた。
3.HとLのキメラフェリチンを作製することを目的にHフェリチンとLフェリチンの遺伝子をマルチクローニングサイトのあるプラスミドベクターに組み込んで発現させた。電子顕微鏡での観察では24量体を形成していることが確認された。鉄酸化速度は野生株とかわらなかった。電気泳動で調べたところLフェリチンが発現していないことがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1.Lフェリチンへの酸化活性部位の導入はY24EとG62H変異株のみが可溶部分として得られ、24量体のフェリチン分子が得られたことも確認できたが、他の変異体は不溶画分になってしまった。カエルのフェリチンを用いた類似の実験ではうまく行っている報告がでているので問題ないと考えていたが、予想外のことで予定が遅れた。鉄酸化活性を得るには少なくとも３残基の導入が必要と考えているので、次年度以降もこの課題が残ることになった。
2.Hフェリチンの遺伝子が得られ、鉄酸化活性も高いことが確認されたので予定を達成できたと考えている。
3.マルチクローニングサイトによりHフェリチンだけ発現したとしても鉄酸化速度が変化していないのはおかしいので現在調査中である。HとLのキメラフェリチンを作ることはまだ達成できていないと考えている。マルチクローニングサイトが十分に働いていないことも考えられるので、引き続き発現状態の確認をしなければならない。また、酸性溶液中での再構成も試すことになるので、予定より若干遅れる。
4.静電ポテンシャルの計算は、ある程度鉄酸化活性のあるフェリチンが得られていないのでまだ行っていない。前期項目がある程度達成できてからかかる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.K59Eにすると構造ができないということは59の近傍にあるLサブユニットの残基と59Eが立体構造的に干渉していることが考えられる。立体構造からみると141番目のリジンが妨害していることが予想されるので、この部分をHサブユニットと同じアラニンに変更して、酸化活性部位の導入を試みる。酸化活性部位を構築するには少なくとも3残基が必要だと考えているので、他の残基の置換をためして、必ず酸化活性部位の導入を実現したい。
2.なぜHフェリチンで２つのピークがでるか解明する。SDS電気泳動、電子顕微鏡では２つの違いは見られない。イオン交換で差がでるということは表面の電荷に違いがあると予想されるので、遺伝子およびプラスミドに不具合がある可能性もあり、確認をおこなう必要がある。HフェリチンはLフェリチンに比べて沈殿しやすいという感触を得ているが、アメリカのグループではHフェリチンを使用しているので、遺伝子やクローンしたタンパク質の確認を行う予定である。また、反応条件についても検討する。
3.マルチクローニングサイトがうまく機能していない。遺伝子の入れ方を検討してみるとともにシングルクローニングサイトをもつプラスミドを２種類いれることも検討してみる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
残額は７万円程度で年度の終わりを迎え、学生の交代の時期になったので無駄な購入は控え次年度に繰り越すことにした。
当初の計画にない新しいタンパク質の変異体を作成することになったので、そのための資金として使用する。
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Research Products
(6 results)
