2013 Fiscal Year Research-status Report
生きている細胞の内部構造とその変化をその場観察するハイブリッド顕微鏡の開発
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25390134
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Japan Atomic Energy Agency |
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Principal Investigator |
加道 雅孝 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門 量子ビーム応用研究センター, 研究主幹 (30360431)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 軟X線顕微鏡 / 蛍光顕微鏡 / 細胞内小器官 |
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| Research Abstract |
蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡を併用したハイブリッド顕微鏡の実現に必要な新型試料ホルダー及び新しい窒化シリコン窓の設計及び製作を行った。新型試料ホルダーは細胞を試料ホルダーに生きたまま封入した状態で蛍光顕微鏡で40倍の高倍率観察が可能となる構造とし、蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡による細胞の同時観察を可能とした。一方、窒化シリコン窓表面に厚さ5μｍ、幅5μｍのスペーサーと溝構想を構築することにより細胞を取りまく培養液の層の厚さを常に一定に保つとともに培養液の余剰分を外部に排出する構造とした。さらに、窒化シリコン窓とPMMAフォトレジストに密着度をトルクレンチによって正確にコントロールできる。
新型試料ホルダーを窒化シリコン窓を用いて生きている細胞の観察を行った。まず、一定の現像条件の下でPMMAの現像を行った結果、細胞周辺の培養液の厚さが安定して5μｍに保たれていることを確認した。これは、非常に再現性よく細胞の軟X線顕微鏡観察が可能であることを意味し、軟X線顕微鏡を生命科学研究に活用する際に非常に重要である。ネズミの精巣ライディッヒ細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡により生きている状態で観察した結果、双方の顕微鏡において細胞核周辺に非常に多くのミトコンドリアが密集して分布していることが観察された。蛍光顕微鏡ではそれらのミトコンドリアを個々に分離して観察することは出来なかったが、軟X線顕微鏡により単一のミトコンドリアの構造の観察に成功した。
新型試料ホルダーと細胞周辺の培養液の層の厚さを正確に制御可能な窒化シリコン窓を組み合わせることにより、蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡により生きている細胞を再現性よく観察することが可能となるとともに、軟X線像のコントラストの向上に成功し、生きている細胞の細胞内小器官の構造を詳細に観察することが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書に記載した研究の目的は、生きている細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡で同時に観察可能なハイブリッド顕微鏡の開発である。平成25年度の研究実施計画は、新型試料ホルダー及び新しい窒化シリコン窓を製作し、細胞の観察を行うことにより細胞の軟X線顕微鏡像と蛍光顕微鏡像の直接比較が可能で細胞周辺の水の層の厚さが常に一定であることを実証するというものであり、本年度に実施した研究実績は平成25年度の研究実施計画に完全に沿ったものであるとともに、当初予定した成果を挙げている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度は、生きている細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡で同時に観察可能な“ハイブリッド顕微鏡”の本体部の設計と製作を行う。ハイブリッド顕微鏡本体部は、倒立型蛍光顕微鏡の試料ステージ上に設置できるよう、非常にコンパクトであることが要求され、（１）軟X線源と試料を格納するための真空容器と真空排気装置、（２）出力20J、パルス幅600psの高強度レーザーを金属薄膜ターゲットに集光照射するためのレーザー集光部およびターゲット部から構成され、（３）平成25年度に開発した新型試料ホルダーを取り付けることにより生きている細胞の軟X線顕微鏡像と蛍光顕微鏡像を同時に撮像可能な構造とする。
高強度レーザーを金属薄膜ターゲットに集光する集光レンズは、真空容器に直接取り付けることにより、蛍光顕微鏡観察時に真空容器を移動した際にレーザーのターゲットへの集光がずれないようにする。試料ホルダーは、真空容器底面に外部から取り付け、試料ホルダーにより真空容器内の真空を保持する構造とすることにより細胞試料交換を容易にするとともに、蛍光顕微鏡観察を可能とする。軟X線顕微鏡本体部を倒立型蛍光顕微鏡の試料ステージ上に取り付けることにより細胞の軟X線顕微鏡像と蛍光顕微鏡像を同時に撮像出来るようにする。ターゲットは直線導入端子を用いることにより、真空容器外部からの交換を可能とするとともに、真空を破ることなく複数回のレーザー照射を可能とする。
平成27年度は、平成25年度に製作した新型試料ホルダーと平成26年度に製作したハイブリッド顕微鏡本体部を組み合わせ、ハイブリッド顕微鏡として完成させるとともに、これまでに実績のあるマウスの精巣ライディッヒ細胞を用いて、蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡による同時観察を実施することによりその性能試験を実施する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成２５年度予算にて計画していた「新型試料ホルダー及び新しい窒化シリコン窓」の製作物品購入については、既存の装置からの転用が可能なことが期中に判明したため、製作を取りやめ、代わりに次年度以降のハイブリッド顕微鏡の更なる高性能化に予算を有効利用することとした。
次年度使用額は平成26年度に計画しているハイブリッド顕微鏡の本体部分の製作において、顕微鏡の更なる高性能化に活用する。
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