2014 Fiscal Year Research-status Report
金属タンパク質の分布測定を指向した多次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の開発
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25410139
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
齋藤 伸吾 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (60343018)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | メタロミクス / スペシエーション / ゲル電気泳動 / 金属タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題では，「生体中微量金属イオンがどのタンパク質にどれだけ結合しているか」を計測するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）を基盤とした簡易で高感度なスペシエーション技術を確立することを最終目的とする。本年度は，前年度に開発に成功した汚染金属イオンスウィーピング（MICS）-ブルーネイティブ-（BN）-PAGE／金属検出PAGEシステムを用いて紅色光合成細菌のペリプラズム空間試料中の銅イオンの分布の計測を試み， CopIタンパク質が新規銅結合性タンパク質であることを明らかにした。このことは，MICS-BN-PAGEが新規金属タンパク質（メタロタンパク質）の同定手法として有用であることを示している。
MICS-BN-PAGEではホロ型（金属結合型）とアポ型（金属解離型）タンパク質で異なる位置にメタロタンパク質が泳動されることが分かっているが，この現象を利用して一次元目でMICS-BN-PAGEを行い，ゲル中のメタロタンパク質から金属イオンを溶離させてアポ型へと化学種変換し，その後，二次元目として再度MICS-BN-PAGEを行うホロアポ変換-二次元MICS-BN-PAGEの開発を行った。この方法では原理的にホロ型のメタロタンパク質だけが対角線上から外れて泳動されるはずである。そこで鉄結合性タンパク質のトランスフェリン（Tf）および銅結合性タンパク質であるCpとスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）のホロおよびアポ型タンパク質の混合溶液を，このホロ－アポ変換二次元MICS-BN-PAGEに用いたところ，実際にホロ型タンパク質を二次元図の対角線上から単離することに成功した。今後はこれらのメタロタンパク質に結合していた金属イオンを金属検出PAGEで検出できるかを検討すると共に，および実試料中のメタロタンパク質の測定が出来るかを試みる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画通りに，金属タンパク質に特化した二次元電気泳動法（ホロ-アポ変換二次元-MICS-BN-PAGE）が混合標準タンパク質試料に対して機能することを見出し，原理通りに機能していることが確認できた。また，昨年に開発した汚染金属イオンスウィーピング（MICS）-ブルーネイティブ-（BN）-PAGE／金属検出PAGEシステムが細菌試料に対しても有効に機能することを示すことにも成功し，新規金属タンパク質の発見に至っており，順調に研究は進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，計画にあるホロ-アポ変換二次元-MICS-BN-PAGEに金属検出PAGEを統合し，メタロタンパク質を単離するだけでなく，そこに結合していた金属イオンの種類と量を計測できるホロ-アポ変換二次元-MICS-BN-PAGE／金属検出PAGEシステムの開発に挑戦する。さらにこれまでに金属検出PAGEで検出できなかった金属種を検出可能な蛍光プローブの開発も併せて行う予定である。
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| Causes of Carryover |
昨年度は当初の計画通りに研究が進み，実験の失敗も想定よりも少なく，昨年度使用した試薬類の残りを今年度使用できたこと，また，校費（研究費）等である程度，物品費を賄えたことから，旅費以外の経費がかからなかった。研究が順調に進み，来年度は多くの生体試料に経費がかかることが予想されるため，次年度使用額とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
種々の生体試料の前処理用試薬やゲル電気泳動用試薬および標準タンパク質などの高額な試薬の購入に使用する予定である。また，昨年度までにまとまった研究結果を得ることができたため，国際学会での成果発表のための旅費にも使用する予定である。
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