2014 Fiscal Year Research-status Report
微小分散液滴を利用したバイオメディカル分析法の開発
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25410153
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Research Institution | Doshisha University |
Principal Investigator |
橋本 雅彦 同志社大学, 理工学部, 准教授 (20439251)
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Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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Keywords | エマルジョン / 油中水滴 / デジタルPCR / ポリジメチルシロキサン / マイクロ流体デバイス / 単一分子 / 変異検出 / DNA |
Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、ポリジメチルシロキサン (PDMS) 製のマイクロ流体チップの高いガス溶解性を利用した自律的マイクロ流体送液法を適用することにより、外部ポンプを必要とせず、デッドボリュームも伴わないハンズフリーな単分散液滴ジェネレータの開発に引き続き取り組み、本ジェネレータの基本性能を評価するとともに、生成した液滴がドロップレットデジタルPCR(ddPCR)の微小反応容器として機能するか検証した。 Tジャンクションを有するPDMS製のマイクロ流体チップを新規にデザインし使用した。カバーガラスを用いて出口リザーバをシールした状態でデシケータの中に入れ、真空ポンプを用いて90分間脱気を行った。その後、本チップをデシケータから取り出し、二つの入口リザーバに油相および水相をそれぞれ加えた。注入された油相および水相は、自律的に出口リザーバへと輸送され、Tジャンクションにおいて油中水滴の生成が確認された。生成速度は、生成開始からおよそ40分後に最大 (ca. 10 Hz) となった後、なだらかに低下していった。しかし、このような生成速度の変化にも関わらず、液滴の粒径は生成開始から終了まで約90 μmでほぼ一定であり、標準誤差は各測定時間における平均粒径の0.3%以内であった。このように、本法によって単分散性の高い油中水滴を再現性よく自律的に生成させられることが実証された。 次に、変異型DNAサンプル溶液をそれぞれ水相に用いて液滴を調製し、PCR終了後、1,000個以上の液滴の蛍光強度を測定しヒストグラムを作成した。液滴数に対して変異型DNA分子の数を10%とした場合では、蛍光強度解析した液滴の10.1%の液滴が閾値以上の蛍光強度を示しており、ポアソン分布から予想される割合 (9.5%) とほぼ一致した。この結果より、液滴内で一分子からのPCR増幅が成功したと結論付けることができる。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
単分散性の高い油中水滴をデッドボリュームを伴うことなく簡便に調製する非常に新規性の高い手法を確立することができた。また、脱気時間、チャンネル寸法を変更することにより、液滴のサイズおよび生成速度の制御が可能であることを見出した。さらに、調製した液滴がドロップレットデジタルPCRのための微小反応容器として機能することを実証することができた。現在のところ、液滴の生成スピードは、当初目標よりも低く、ドロップレットデジタルPCR後の液滴の自動スクリーニングは未だ達成されていない。
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Strategy for Future Research Activity |
前述したとおり、粒径の揃った油中水滴の自動調製を可能とする独創的な手法を確立することができたが、その調製速度は当初目標よりも低くなっている。そこで、今後は調製速度を改善するために、デバイスの改良と実験条件の最適化を行う。また、ドロップレットデジタルPCR後の液滴の高速自動スクリーニングを最終目標としているため、それを可能とする基盤技術の確立を目指して研究に従事していく。
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Research Products
(8 results)