2013 Fiscal Year Research-status Report
蛍光性リポソームを用いた酵素阻害剤スクリーニングシステムの開発
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25410154
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Ryukoku University |
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Principal Investigator |
宮武 智弘 龍谷大学, 理工学部, 教授 (10330028)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 酵素 / 酵素阻害剤 / 蛍光センシング / リポソーム / 膜透過性ペプチド |
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| Research Abstract |
本研究では、医薬品の開発に不可欠な酵素阻害剤のスクリーニングを、従来法よりも簡便かつ迅速に行うことができる全く新しい蛍光検出型の分析システムの開発を目指す。カチオン性のポリマーがリポソームの脂質二分子膜を透過する現象を応用して、酵素反応溶液中の基質の濃度変化を蛍光強度の変化として検出する。こうして酵素反応を可視化し、酵素阻害剤の活性評価を容易にするラベルフリーなスクリーニングシステムを構築する。
今年度は、①カチオン性ポリマーであるポリアリルアミンを膜透過性分子として用い、細胞内でのシグナル伝達に関わる生理的に重要な酵素であるプロテインキナーゼならびにその阻害剤の活性を評価する研究、②酵素センシングの感度向上を目的とし、新規な膜透過性分子を開発する研究、をそれぞれ実施した。
①プロテインキナーゼ阻害剤活性の評価：文献記載の一般的な方法でプロテインキナーゼ反応を行い、反応液を逐次サンプリングして緩衝溶液中に加えた。そこに、蛍光性リポソーム、および膜透過性のポリアリルアミンとドデシルホスフェイトを加え、蛍光強度を測定した。ポリアリルアミンの膜透過を抑制する働きを持つATPが、酵素反応の進行に伴って消費されることを利用し、プロテインキナーゼ反応の蛍光センシングを行うことができた。さらに、プロテインキナーゼ反応溶液に酵素阻害剤を加えることで阻害剤活性の評価も行い、Daphnetinなど３種のプロテインキナーゼ阻害剤の蛍光センシングに成功した。
②新規膜透過性ペプチドの開発：膜透過活性を有するオリゴペプチドであるヘキサアルギニンに、疎水性の置換基としてピレニル基を導入した新規な膜透過性ペプチドを合成した。この分子は、ヘキサアルギニンよりもより低濃度（約１０分の１）で膜透過活性を発現することが確認でき、酵素反応の高感度センシングに役立つことが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究により当初の目標の一つであった、プロテインキナーゼの活性評価と、その阻害剤３種の活性評価を行うことができた。本システムは、基質にラベルを行うことなく、酵素反応溶液を直接サンプリングすることによって、蛍光で、目視によっても酵素およびその阻害剤の活性を評価できるシステムである。本実験においては、蛍光光度計を用いて蛍光強度を定量的に測定したが、紫外線照射下で蛍光色素を発光させることで、目視によっても簡便に定性的な評価が行えることも確認している。また、酵素活性の評価においては、より少量の酵素反応溶液のセンシングを行うことが望まれるが、その課題解決に向けて、より低濃度で作用する新規な膜透過性分子の開発を行った。従来から膜透過活性を有することが知られているヘキサアルギニン分子に対し、脂質二分子膜の疎水領域を透過しやすいよう疎水性の置換基としてピレニル基を導入することによって、膜透過活性の向上を試みた。合成した分子は期待通り、ヘキサアルギニンよりも高い膜透過活性を有することが確認できた。
以上のことから、当初計画していた研究を進展させることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で実施している酵素活性の蛍光センシングシステムは、膜透過性分子と基質分子との相互作用をベースにして、酵素の活性を評価していることから、原理上さまざまな酵素反応系へと展開できることが期待される。今後は、プロテインキナーゼ以外の生理的に重要な酵素として、グリセロキナーゼ、クレアチンキナーゼあるいは、キナーゼ以外の酵素として逸脱酵素として知られる乳酸脱水素酵素等にも本システムが適応可能かを検証し、本評価システムの汎用性向上を実証する試験を行う。また、酵素活性評価の感度を向上させることは、より少量の酵素を用いて活性評価を行なえることにつながり、医薬品開発等における酵素活性評価試験のコスト低減につながる重要なテーマである。今年度の研究で新規に合成した膜透過性ペプチドを酵素活性評価に適応する試験を行い、酵素活性の蛍光センシングの感度向上に向けた試験を並行して推進する。
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