2013 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質分子表面改変に基づく新規poly-extremozymeの創製
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25410172
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
中村 聡 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (50227899)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 極限環境微生物 / 極限酵素 / アルカリキシラナーゼ / 分子表面電荷 / 耐アルカリ性 / 耐熱性 / 耐塩性 |
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| Research Abstract |
好アルカリ性細菌Bacillus sp. 41M-1株が生産するGHファミリー11キシラナーゼXynJは，反応至適pHをpH 9.0にもつアルカリ酵素である。糸状菌由来酸性キシラナーゼに関する先行研究に倣い，XynJの触媒ドメイン領域の分子表面（Ser/Thr表面）に5つのArgを導入した変異型酵素において耐アルカリ性と耐熱性の向上が観察されたが，その理由については未解明であった。そこで平成25年度は，5つの変異箇所Ser26，Thr34，Asn74，Asn76およびAsn192について，Argへの置換を2ないし3箇所適宜組み合わせて導入した変異型酵素を調製し，当初導入した5つの変異箇所のうち，どの変異箇所が耐アルカリ性・耐熱性の向上に重要かを調べることとした。精製酵素を用いた検討の結果，耐アルカリ性の向上には少なくとも3箇所，そして耐熱性の向上には5箇所すべての変異が必要であることがわかった。
耐塩タンパク質については，その分子表面の酸性アミノ酸が水分子と強く結合することで耐塩性が発現するといわれている。この仮説に基づけば，当該酸性アミノ酸は塩基性アミノ酸でも代替できることになる。そこで，XynJのSer/Thr表面に塩基性アミノ酸Lysあるいは酸性アミノ酸AspおよびGluを3ないし5箇所導入した各種変異型酵素を調製し，耐アルカリ性・耐熱性だけでなく，耐塩性に及ぼす塩基性および酸性アミノ酸導入の差異を調べることとした。精製酵素を用いた検討の結果，分子表面への塩基性アミノ酸の導入により，比活性は低下するものの，耐アルカリ性が向上することがわかた。また，分子表面に5つのArgを導入した変異型酵素のみ耐熱性の向上が認められた。さらに，耐塩性の向上には分子表面への酸性アミノ酸の導入よりは，むしろ塩基性アミノ酸の導入の方が効果的であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
極限環境微生物が生産する極限酵素の極限環境耐性機構については不明な点が多いが，タンパク質分子表面のアミノ酸が極限環境耐性に大きな影響を及ぼしている例が少なくない。本研究では極限酵素の分子表面アミノ酸に注目し，(1)極限酵素がもつ固有の極限環境耐性発現の分子機構を解明し，(2)耐アルカリ性・耐熱性・耐塩性の分子機構における普遍性と独立性を調べた上で，(3)複数の極限環境耐性を有する新規極限酵素（poly-extremozyme）を創製することを目的としている。平成25年度においては，好アルカリ性細菌Bacillus sp. 41M-1株由来アルカリキシラナーゼの分子表面に荷電アミノ酸（塩基性および酸性アミノ酸）を導入した各種変異型酵素を調製し，耐アルカリ性・耐熱性・耐塩性を調べることで，分子表面電荷と各種極限環境耐性との関連性を明らかにしており，研究はおおむね順調に推移しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度以降は，耐塩キチナーゼChiN1の分子表面に酸性および塩基性アミノ酸を導入した各種変異型酵素を調製し，耐塩性・耐アルカリ性・耐熱性を調べることで，分子表面荷電アミノ酸と各種極限環境耐性との関連性を明らかにする。また，既に超高度の耐熱性を獲得している超好熱性細菌由来キシラナーゼXynTBに対し，上で得られた知見に基づきさらなる分子表面改変を施すことで，複数の極限環境耐性を併せもつ究極の新規poly-extremozymeの創製を達成する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
分子表面に酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸を導入した各種変異型酵素の精製方法は未知であった。当初は，キチンビーズ充填カラムなど，種々の精製用カラムの購入を想定していたが，研究室で保有している陰イオン・陽イオン交換カラムを用いて精製することができたため，平成25年度に残額が生じた。
各種変異型酵素のより効率的なスクリーニングの実施を目的として，平成26年度にハイスループットスクリーニング系を立ち上げる。その際に用いる，96穴プレート用振とう培養機などの購入に充当する。
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[Presentation] Characterization of a haloarchaealchitinase: Effect of aspartates, glutamates and lysines on its protein surface2013
Author(s)
Kinuka Toyama, Koichi Sakagami, Zhang Yang, Ann Ran, Motoaki Sato, KeitaOrishimo, YoshinoriHatori, Rie Yatsunami, TomonoriTakashina, Toshiaki Fukui, Satoshi Nakamura
Organizer
10th Asia-Pacific Chitin & Chitosan Symposium (第10回アジア・太平洋キチンキトサンシンポジュウム)・第27回キチン・キトサンシンポジウム
Place of Presentation
米子コンベンションセンター（鳥取県米子市）
Year and Date
20131004-20131008
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