2014 Fiscal Year Research-status Report
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25410174
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| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
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Principal Investigator |
田中 俊樹 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70171775)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 銅イオン / ブルー銅タンパク質 / デノボ設計タンパク質 / ヘリカルバンドルタンパク質 / 安定性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に、設計したブルー銅タンパク質の疎水場のアミノ酸を変位させることで、酸化還元電位の調節を行った。今年度は、このタンパク質を基にレッド銅タンパク質の設計を行った。天然のレッド銅タンパクは、ブルー銅タンパク質の銅イオンにさらに水が配位し、タイプII型の銅イオンの配置となる。そのような配置を考えたが赤色でなく黄色を呈した。そこで、２つのCys残基が配位した天然タンパク質を参考に、Cys残基を種々の場所に加えた。その内の一つが赤色を呈した。このタンパク質について詳細を調べた。EPR、EXAFSなどの物理科学的分析から、このタンパク質はタイプ1.5型の構造であることが示唆された。これまでに天然タンパク質では見つかっていない新規な銅イオンの配位構造を有している。酸化還元電位を測定するために、種々の測定方法を試したが、まだ信頼できる値は得られていない。
非常に安定なタンパク質を作製する目的で、昨年度に３本鎖へリックスバンドルタンパク質のループ部分にジスルフィド結合を導入したタンパク質を作製した。このタンパク質は50%エタノール溶液でも三次構造が保たれていることがわかった。そこでルテニウムの結合実験を行ったが、まだ結合の確認にはいたっていない。今年度はさらに、４本鎖へリックスバンドルタンパク質についても試みた。ジスルフィド結合はへリックス間に入れた。コンピューターでモデル構造を作製し、適切と思われる位置にシステインを導入した。このタンパク質が実際にジスルフィド結合ができているのを確認した。本タンパク質を用いて、ブルー銅タンパク質にする予定である。この事で、銅イオンの配位を安定化し、以前に問題があった退色を遅くする効果が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ブルー銅タンパク質を基に、レッド銅タンパク質に銅イオンの配位構造を変える事ができた。この酸化還元電位の測定に工夫を行ったが、まだ正確な値が得られていない。また、タンパク質の安定化において、ジスルフィド結合を適切な位置に導入し、この操作により、50%エタノール溶液でも立体構造を保つことのできるタンパク質を作製できた。しかし、ルテニウムの配位を試みたが、まだ'ルテニウムの結合を確認できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度で達成できなかった、酸化還元電位の測定を行う。安定なヘリカルバンドル型タンパク質の改良を行いながら、銅やルテニウムなどの金属イオンの結合実験を行う。
ブルー銅タンパク質から、二つの銅イオンを持つタイプIII型の配位構造を持つタンパク質の設計、構築を行う。
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| Causes of Carryover |
今年度は、装置の大きな修理が発生しなかったため、大学からの基盤経費を研究に用いることができた。これまでに作製したタンパク質は不安定であったため、EPR、酸化還元電位などの測定の条件設定に時間がかかった。そのため、予定していた変異体が作製、また構造解析用のタンパク質が作製できずに費用が残った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度に、安定なタンパク質の作製に成功している。このタンパク質を大量に作製し構造解析に利用する。
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