2013 Fiscal Year Research-status Report
新規pH応答性蛍光核酸による高感度なDNA一塩基識別法の開発
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25410180
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
齋藤 義雄 日本大学, 工学部, 准教授 (40385985)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | pH環境 |
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| Research Abstract |
これまでに予備実験として、我々の独自のコンセプトに基づき、天然の核酸塩基に三重結合を経て置換芳香族化合物を連結した一群の蛍光核酸塩基を合成している。これらの化合物のうち、アニリン誘導体およびアントラセンを導入した核酸塩基誘導体が、pH環境に鋭敏に応答して発光‐消光のスイッチングを行うことが分かっている。これらの化合物は、いずれも中性から塩基性環境においては、電子供与性基であるアニリン部位とアントラセン部位との間で光誘起電子移動（PET）が起こり蛍光消光されるのに対して、酸性環境下ではアニリン誘導体がプロトン化され蛍光発光するという性質を有している。すなわち、pH変化に伴うプロトン化-脱プロトン化により蛍光発光のOn-Offスイッチングが可能な蛍光核酸であるといえる。この化合物のpKaを分子設計に基づいて調整することで様々なpH領域での蛍光発光のスイッチングが可能になると考えられる。実際に同様の分子設計に基づき、ピリジン誘導体を含む蛍光核酸分子を合成することで、これまでの結果とは逆に、中性から塩基性領域で発光する分子も得られることもこれまでの予備実験の結果からわかっている。そこで当該年度である平成２５年度は、このような予備実験データに基づき、目的とするpH領域で蛍光スイッチングを行い、さらに長波長側で強く発光するpH環境応答性の蛍光核酸塩基の開発を目指して種々の誘導体を合成した。本年度はピリジン誘導体を中心に４種類の化合物の合成を達成し、それらの光学特性の検討を行なった。まだ蛍光発光のOn-OffスイッチングのpH領域が酸性に寄り過ぎているものの、目的の中性～塩基性領域で発光する分子を得ることに成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現段階での研究の進捗状況は、おおむね順調であると考えている。予備実験を行なった時からこれまでに、新たに４種類の新規蛍光核酸分子の合成に成功しており、それらの化合物の様々なpH環境下における光学特性（蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルなど）の評価を既に終了している。光学特性を評価した結果より、いずれの化合物も、中性～塩基性領域で非常に強く発光することがわかり、目的とする性質を有する分子が得られたと考えられる。また発光波長も十分に長波長側にあることがわかり、この点からも目的とする分子に近いものが得られたといえる。これらは、研究計画調書で平成２５年度に計画していた内容とほぼ同様であるといえる。
しかしながら、本研究の目的を達成するためには、蛍光発光と消光の切り替わるpHが、現在得られている化合物よりもさらに中性付近にある分子が好ましいため、平成２６年度は更なる性能の向上を目指して新しい化合物の開発を平行して行なう予定である。
平成２５年度の研究は、おおむね順調に進展しているため、平成２６年度は、研究計画調書の計画に従い研究を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNA鎖内に多数存在するリン酸アニオンの影響により、DNA中のpH環境は局所的に非常に大きく異なることが知られている。特に最近の研究では、一本鎖DNA中に導入した化合物のpKaが、二重鎖を形成することで1以上も変化することが報告されている。つまり、DNA周辺のpH環境は、二重鎖、一本鎖やバルジ、ループ構造などの変化により大きく異なっており、一塩基ミスマッチのような僅かな構造変化でもpH環境に鋭敏に応答するインテリジェントなpH蛍光核酸塩基を用いることで蛍光のOn-Offの変化として捕えることが可能であると考えられる。したがって平成２６年度は、前年度までに得られた高性能なpH環境応答型の蛍光核酸塩基をオリゴヌクレオチド鎖に導入して、DNAプローブとしての性能評価を中心に進めてゆく予定である。
我々はこれまでに、周辺の極性環境に敏感に反応して蛍光発光する核酸塩基を導入したDNAプローブを作成し、それらが相補反応により二重鎖になった時に蛍光発光能を持つ現象を応用した特定塩基配列の識別法の開発を行ってきたが、本申請ではそれらの蓄積を生かし、この手法を応用してpH環境応答型の蛍光核酸塩基を新たに開発する。有望な蛍光DNAプローブが得られればモノマーの蛍光核酸塩基のさらなる最適化を行い一塩基識別能の向上を目指す。また、平成２５年度に引き続き、蛍光スイッチングする領域がより中性に近い化合物の開発を継続して行なう予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成２５年度は、前半の段階で分子の設計に時間がかかり、実際の化合物の合成に取りかかるのに時間を要してしまった。しかしながら、実際に合成を開始すると、予定より早く化合物を得ることが出来たため、当初の金額よりも少ない金額で、考えていたよりも多くの分子の合成を達成することが出来た。次年度は、平成２５年度に得られた分子をDNA鎖に導入する予定であるが、当初の予定より多くの化合物が得られたため、次年度使用額が生じた。
次年度は、平成２５年度に得られた分子をDNA鎖に導入する予定である。上述のように、DNA合成試薬は、一般の有機合成試薬に比べて高価なものが多い。平成２５年度に当初の予定より多くの化合物が得られているため、当初計画より多い予算が必要となっている。
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Research Products
(2 results)
