2014 Fiscal Year Research-status Report
ヒトアルゴノート2タンパクの機能構造に基づくsiRNAの最適化学構造の探索
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25410182
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
藤井 政幸 近畿大学, 工学部, 教授 (60199297)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 核酸関連化学 / 遺伝子サイレンシング / 化学修飾siRNA / アルゴノート２ / 遺伝子デリバリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1．ヒトアルゴノートタンパク質MIDドメインの機能構造に基づく5’-末端修飾による最適siRNA化学構造の探索
1-1.センス鎖5'-末端の化学修飾により次のことを明らかにした。(1)センス鎖5’-Tにより不安定化し, センス鎖が選択される確率が向上した。(2)センス鎖5’-アミノTもTと同程度に不安定化し, センス鎖が選択される確率が向上した。(3)センス鎖5’-アミノTが特にサイレンシングを妨げる訳ではない。(4)センス鎖5’-アミノTはRISC Loading Complexの形成, Ago2への積み込みを阻害しない。(5)センス鎖5’-アミノTの導入により、off-target効果は回避できる。(6)鎖選択はDicerとの結合, あるいはRISC Loading Complexの形成の際に決まっている。(7)センス鎖5’-アミノTによりアンチセンス鎖が選択される確率が向上する訳ではない。
1-２．アンチセンス鎖5’-末端修飾に理次のことを明らかにした。(1)アンチセンス鎖5’-アミノTはRLCの形成、Ago2への積み込み(RISCの形成)を阻害した。(2)アンチセンス鎖5’-Tにより不安定化し, アンチセンス鎖が選択される確率が向上した。
2. 両親媒性ペプチドRLｎによるsiRNAの無毒性細胞導入法の開発
両親媒性ペプチドRLｎ-siRNA複合体は細胞膜をよく透過し、ヌクレアーゼによる分解に対して耐性で、細胞毒性も全くない。その膜透過性を向上させるために長鎖脂肪酸、PEG、細胞認識糖鎖、ガン細胞特異的リガンド、シグナルペプチドなどとのコンジュゲートを化学合成し、その細胞膜透過性、細胞毒性およびサイレンシグ効率を評価した。その結果、ある種の長鎖脂肪酸およびPEG鎖で修飾したRLn-siRNA複合体は細胞膜透過性が著しく向上すること見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
3年間で達成すべき目的として掲げた下記4つの研究目的のうち（3）を残して他3つの目的をほぼ計画通りに達成した。
（１）MIDドメインの機能構造に基づく5’-末端修飾による最適siRNA化学構造の探索
（２）PAZドメインの機能構造に基づく3’-末端修飾による最適siRNA化学構造の探索
（３）MIDドメインの機能構造に基づくhAgo-RNAコンジュゲートによる人工RNAi装置の創製
（４）両親媒性ペプチドRLｎによるsiRNAの無毒性細胞導入法の開発
また、当初目的としていなかった追加の項目についてもかなりの進展があり、最終的には当初の目標を上回れる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
下記（3）の研究目的を当初の計画通りに遂行して結果を得る。
（3）hAgo-RNAコンジュゲートによる人工RNAi装置の創製
hAgo2のMIDドメインのLys906はsiRNAのガイド鎖5’-末端リン酸基に近接している。ガイド鎖5’-末端をアミノ基と反応するカルボニル基などの官能基で修飾したsiRNAをhAgoに取り込ませると、溶液中で自発的に共有結合を形成すると考えられる。Lys906のアミノ基をガイド鎖5’-末端と共有結合でつないだhAgo-RNAコンジュゲートを合成し、そのhTERTおよびbcr/abl遺伝子に対するサイレンシング効果を詳細に評価しながら、最適siRNA化学構造を探索する。siRNAは細胞内でのヌクレアーゼ分解により短寿命であるが、hAgo-RNAコンジュゲートは細胞内でより安定で大きなターンオーバーが期待でき、off-target効果も完全に解消されるため、優れた人工RNAi装置が創製できる。
また、追加項目として下記の2点についても検討して、時間の許す限りにおいて結果を得たい。（1）ミスマッチやバルジを有するmiRNA様siRNAを化学合成して、サイレンシング効果を評価し、最適なsiRNA分子構造を探索する。（2）siRNA-コンジュゲートのケモエンザイマティック合成法を開発して、siRNA多重コンジュゲートを合成する。それにより、より多機能なsiRNAを分子デザインする。
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[Presentation] GENE SILENCING BY CATIONIC SIRNA2014
Author(s)
Ayumi Takashina, Hikari Kayano, Tomohiro Emi, Madoka Naemura, Yojiro Kotake, Jumpei Ariyoshi, Asako Yamayoshi, Akira Murakami and Masayuki Fujii
Organizer
The 41st International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
Place of Presentation
北九州国際会議場(福岡県北九州市）
Year and Date
2014-11-05 – 2014-11-07
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[Presentation] CATIONIC CHARGE ON SIRNA AND RNAI EFFECT2014
Author(s)
Ayumi Takashina, Hikari Kayano, Tomohiro Emi, Kana Murakami, Noriko Ogawa, Jumpei Ariyoshi, Asako Yamayoshi and Masayuki Fujii
Organizer
XXI Round Table on Chemical Biology of Nucleic Acids
Place of Presentation
ポズナン大学（ポーランド、ポズナン）
Year and Date
2014-08-24 – 2014-08-29
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