2013 Fiscal Year Research-status Report
肢再生制御蛋白質におけるGPIアンカー機能の膜存在下での固体NMRによる解明
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25410187
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Suntory Foundation for Life Sciences |
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Principal Investigator |
三浦 薫 (野村 薫) 公益財団法人サントリー生命科学財団, その他部局等, 研究員 (90353515)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | GPIアンカー型蛋白質 / 脂質二重膜 / 固体NMR / 肢の再生 |
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| Research Abstract |
イモリの肢再生制御因子であるProd1のアンカー型蛋白質の調製を行った。Prod1の発現、精製が一通りできる事を確認した後に、Prod1のC末端にアンカーと反応させるためのリンカー部分をつなげた蛋白のサブクローニングを行った。リンカー付Prod1の発現、精製を行った後、このサンプルのHSQCスペクトルを測定した。すでに報告されているアンカーのないProd1の化学シフトの値と比較した結果、ほぼ同じ値を示したことより、Prod1が正しい構造を形成していることを確認した。次にアンカーをバイセル膜に組み込んで、膜中にあるアンカーとProd1を化学的に連結させ、その後、未反応のProd1をゲルろ過により除いた。得られた膜サンプル中のProd1のHPLCの保持時間により、Prod1がアンカーと反応していることが確認できた。次にこの膜サンプルの固体NMRスペクトルを測定したが、得られたスペクトルにより、蛋白質が変性してしまい、構造を取っていない事を確認した。Prod1は分子内にS-S結合を４つ持つ蛋白質であるため、S-S結合をもたないモデル蛋白質を用いてこれまでにおこなってきたチオール-マレイミド反応では、分子内S-S結合が切断される可能性があることから、適応が難しい事が分かった。そこで、S-S結合を持つ蛋白質にも応用できるようにC末端にフリーのチオールを必要としないSortase A酵素を用いた反応を試してみることとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Prod1のS-S結合を保ったまま、蛋白質のC末端のチオールを用いてカップリング反応をすることが難しいことにより、サンプル調整がやや難航している。この点を克服できたら、スムーズに進むものと思われるので、上記のSortase Aを用いた別のカップリング反応を用いることで、本研究は達成できるはずである。
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| Strategy for Future Research Activity |
サンプル調製
Prod1のC末端に遺伝子工学的にSortase Aの認識配列を付加したProd1を大腸菌の大量発現系で発現、精製する。さらに、Prod1とGPIアンカーミミックの連結に必須の酵素であるSortase Aを大腸菌の大量発現系で発現・精製する。また、Sortase Aを用いたカップリング反応に合わせてGPIアンカーミミックの頭部の構造の改良を行う。改良したアンカーミミックを混ぜて作成したバイセル膜にProd1をSortase Aを用いて連結させて、アンカー型Prod1を膜へ挿入する。アンカーの頭部の長さは、実際のGPIアンカーの長さに合わせると、Sortase Aを用いたカップリング反応が膜表面近傍で起こるため、反応が上手く進まない可能性がある。このような場合に備えて、アンカーの長さが長めのものも調製する。
固体NMR測定
調整したサンプルの固体NMRスペクトルを測定し、すでに報告されているGPIアンカーを持たないProd1の溶液NMRスペクトルの化学シフト値と比較し、膜とProd1の間に相互作用があるか、また膜存在下で構造変化が起こっているかどうかを解析する。また、常磁性金属を膜の表面に常磁性イオンを並べたサンプルを調製し、膜表面の常磁性イオンにより引き起こされるProd1の各部位の常磁性緩和を解析することにより、Prod1の各部位の膜表面からの距離を見積もる。
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