2014 Fiscal Year Research-status Report
プロテアーゼ活性維持力増大のためのトリプシン固定化ナノシートの調製とその応用
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25410230
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
坂田 眞砂代 熊本大学, 自然科学研究科, 准教授 (60187391)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ナノ材料 / 酸化グラフェン / ナノシート / 酵素担体 / 固定化酵素 / トリプシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、水溶液中でのトリプシン(タンパク質分解酵素)の活性能を安定化させ、長時間その活性を維持させるために、トリプシン固定化ナノシートを調製することを目的としている。本年度は、固定化酵素の担体として、酸化グラフェンナノシート(ＧＯ)とセルロース粒子 (粒径：50μm)を選択した。これらの担体表面に、活性エステル化によるアミド結合あるいはクリック反応による共有結合で、酵素(トリプシン)を固定化することに成功し、以下のような結果が得られた。
(1) 合成の確認：ＧＯナノシート1gあたりのトリプシン固定化量(620～1160 mg/g)は、セルロース粒子1gあたりの固定化量(4.8 mg/g)と比較すると、100倍以上であった。AFM表面形態観察により、ＧＯナノシート上に固定化されたトリプシンが確認できたた。トリプシン固定化量が多いほどわずかに酵素活性(Vmax)も高くなる。
(2) ＧＯ固定化トリプシンの酵素活性(Vmax)は基質(カゼイン)の分解能を定量することにより評価した。その結果、クリック反応で得られたＧＯ-トリプシンよりも、アミド結合で得られたＧＯ-トリプシンの方が重量あたりの酵素活性能が高く、固定化量が多いほど高い値が得られた。
(3) 上記(3)の方法で酵素活性定量後のアミド結合型およびクリック反応型ＧＯ-トリプシンを緩衝液で洗浄し、再度酵素活性を測定したところ、初回と同等の酵素活性能が得られた。このことより、両固定化トリプシンは、再利用が可能であることも確かめられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) 前年度の固定化酵素担体の調製結果をもとに、酵素活性を阻害することなく、酵素を担体に化学修飾する方法について、詳細に検討した。その結果、アミド結合型固定化トリプシンが最も酵素活性能が高いとい好結果が得られた点では、研究の目的および目標に近づいている。
2) ナノシートを担体として用いることにより、従来のマイクロ粒子型担体に比べて、担体の重量あたり100倍以上のトリプシンを修飾できた。同調製法は、酵素修飾用担体の大幅なコスト削減を達成できる。
3) 本年度の目標のうち、固定化酵素の長期安定性やpH安定性については詳細な結果が得られていないが、何度も再利用が可能である酵素担体の構築法が確立できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) ナノシートの物性調査：アミド結合型固定化トリプシンの合成法を確立する。得られたトリプシン固定化ＧＯナノシートの合成の確認は、前年度と同様な元素分析法およびFT-IR測定およびAFM装置を用いた観察により評価する。
2) 酵素活性能の調査：トリプシン固定化ナノシートのタンパク質 (カゼイン) の分解能に及ぼす溶液のpH, 温度, イオン強度およびエタノール濃度の影響について、詳細に調査する。
3) 固定化酵素の応用：トリプシン固定化ナノシートを種々のタンパク質解析用の分解酵素として応用するための溶液環境 (pH, イオン強度, 温度等)を確立する。タンパク質解析のためのモデル試料の粗精製アルブミンやグロブリン溶液は、(財)化学及び血清療法研究所より提供を受ける。
4) 物理的・化学的評価：上記試料を用いた トリプシン固定化ＧＯナノシートのタンパク質分解活性能は、トリプシンが試料タンパク質を分解して遊離させる種々のアミノ酸を核磁気共鳴(NMR)分光法により分析して評価する。NMR装置は、熊本大学既存の装置を用いる。NMR測定結果の詳細な解析が困難な場合は、熊本大学工学部のNMR解析担当技術員に、解析を依頼する。
5) 総合判断と成果の公表：得られた結果を総合判断し、開発されたトリプシン固定化ＧＯナノシートを用いた新規なタンパク質解析システムが、実用化できるかどうかについて評価する。特許申請を試みる。国際学会および国内学会での成果発表および技術情報交換を行い、応用展開を目指す。
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