2016 Fiscal Year Annual Research Report
Detection of nucleic acids of Cryptosporidium oocyst by surfactant extraction treatment and its application for pathogenic evaluation
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25420559
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
関川 貴寛 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (20511728)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | クリプトスポリジウム / 病原性原虫 / 界面活性剤抽出処理 / 免疫磁気分離 / LAMP法 / 核酸抽出 / 河川水 / オーシスト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに、免疫磁気分離（Immunomagnetic separation: IMS）と界面活性剤抽出処理（Surfactant extraction treatment: SET）を併用したIMS-SET法を開発し、リアルタイムPCR法を用いたクリプトスポリジウム検査の簡便化および高精度化に成功している。本年度は、Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法およびReverse transcription-LAMP（RT-LAMP）法へのIMS-SET法の応用を検討した。LAMP法は等温遺伝子増幅法である。60℃付近の一定温度で遺伝子増幅反応が進行し、反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムが蓄積する。濁度のリアルタイム測定には、温調機能付き吸光度計（MyAbscope, カネカ）を用いた。SET法が濁度測定に及ぼす影響を評価した結果、界面活性剤の添加によるピロリン酸マグネシウムの蓄積および測定への影響は確認されなかった。
オーシスト内部にDNAよりも格段に多く存在している18S rRNAをターゲットにし、IMS-SETとRT-LAMPの併用法を用いて、オーシスト1個相当を含む試料からRNAを高感度に検出することができた。さらに、河川水にオーシストを添加して調製した模擬汚染水を用いてIMS-SETとRT-LAMPの併用法による検出感度を評価した結果、リアルタイムPCR法と同様にオーシストを検出することができた。また、LAMP法はPCR法に比べて、河川由来物質に阻害されやすいことがわかった。
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