2014 Fiscal Year Research-status Report
アフィニティ膜濾過法を導入した遺伝子治療用プラスミドDNA精製プロセスの開発
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25420800
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
片桐 誠之 名古屋大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (00345919)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
入谷 英司 名古屋大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (60144119)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | プラスミドDNA / 精製 / アフィニティ / 膜濾過 / リガンド / 吸着 / 脱着 / 菌体破砕 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、先天性疾患等の治療を目的として、遺伝子治療や遺伝子ワクチンの開発が活発に行われるようになり、医療品純度のプラスミドDNAを大量生産するのに適した産業レベルでの分離・精製法の開発が求められている。本研究では、スケールアップが可能なプラスミドDNAの精製法として膜濾過法に着目し、プラスミドDNAと親和性のあるリガンドを探索するとともに、リガンドと分離膜とを用いるアフィニティ膜濾過法を確立し、プラスミドDNAの精製プロセスを開発することを目的とする。プラスミドDNA精製の第一段として、菌体内に存在するプラスミドDNAを取り出す工程が必要となる。一般的には薬品による溶菌が行われるが、有害物質を含むため、超音波やビーズミルによる菌体破砕、および電気パルスにより細胞膜に穴をあける方法を試み、プラスミドDNAの溶出を検討した。超音波処理ではプラスミドDNAの分解が、またビーズミルではゲノムDNAの切断が生じ、精製が難しくなったが、電気パルスを利用するエレクトロポレーションの導入により薬品を用いる従来法と遜色なくプラスミドDNAを溶出できることがわかった。遺伝子治療に用いる場合の安全面も考慮すると、有害薬品を使用しない点での重要性は大きい。菌体を破砕すると、菌体内の様々な物質が溶出されるため、通常、膜濾過性が著しく低下するが、エレクトロポレーションの操作条件を適切に設定することで、破砕菌体や不純物となる様々な生体高分子の凝集塊が生じ、濾過性が向上することを確認した。凝集塊を膜濾過により取り除いた溶液に対して、リガンドとして酸化鉄を用いるアフィニティ膜濾過を検討し、pHを変化させるだけの容易な操作でのプラスミドDNAの吸・脱着濾過を実現した。今後、プラスミドDNAの溶出効率の向上とリガンドに対する吸・脱着特性の詳細な検討によりアフィニティ膜濾過条件を確立し、精製プロセスの開発を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究成果によりプラスミドDNAの溶出法が確立され、アフィニティ膜濾過条件の検討も進みつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
順調に成果が得られているので、当初の計画に従って、次年度は「アフィニティ膜濾過条件および精製プロセスの確立」を進める。
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| Causes of Carryover |
本年度は、研究室で保管していた試料や試薬なども利用して研究を進めたため、当初の計画より低予算で成果を得ることができた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、当初の計画内容に加えて、「リガンドの探索」も引き続いて行い、本手法における最適なリガンドの選定と精製プロセスの確立を目指し、未使用分をこの費用にあてる。また、研究成果を広く公表するため、様々な学会等での研究発表を積極的に計画する。
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