2013 Fiscal Year Research-status Report
トランスジェニックニワトリ卵を用いた経口免疫ワクチンによるアレルギー治療法の開発
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25420834
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
河邉 佳典 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (30448401)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 腸管免疫寛容 / 経口免疫ワクチン / トランスジェニックニワトリ / アレルゲンエピトープ / エピトープペプチド / MHC / 花粉症モデルマウス |
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| Research Abstract |
本研究では、スギ花粉アレルゲンエピトープ含有ワクチン卵を用いた際の腸管免疫系の活性化メカニズム解析を行うとともに、アレルゲンエピトープを遺伝子工学的に分子改変することで、腸管免疫系への活性化作用をさらに高めた経口免疫寛容誘導可能なワクチン卵によるアレルギー治療法の開発を目的としている。
はじめに、MHC-エピトープ融合タンパク質を生産する遺伝子導入ニワトリ卵を用いて、花粉症モデルマウスにおける花粉症治療を評価した。アレルゲンエピトープは、MHC分子a鎖およびb鎖内に遺伝子工学的に組み入れ、さらに抗体のFc領域と融合させた（MHC-Crp/Fc）。その結果、エピトープ含有卵白を経口投与したモデルマウス群において、くしゃみ回数ならびに血清中IgE量を減少させることができた。これまでスギ花粉症患者での主要エピトープペプチド7つを人工的に連結させた融合タンパク質（cLys-7crp）の場合と比較して、エピトープを限定させても花粉症症状を軽減できることがわかった。モデルマウス個体への経口摂取において、投与回数、量、期間を変更することで、より効果的に確実に腸管免疫寛容を誘導する治療スケジュールを評価することができた。
一方、すでに作製ずみのアレルギー抑制性サイトカインとして働くTGF-β遺伝子が組込まれた遺伝子導入ニワトリの解析を行った。遺伝子導入ニワトリは卵管特異的に目的タンパク質を生産できる発現ユニットとした。ウエスタンブロット法で評価したところ、遺伝子導入ニワトリ由来卵白サンプルにおいて、適切な分子量サイズでバンドを検出することができたことから、TGF-βが生産されていることがわかった。さらにその発現は期待したどおり、卵管特異的であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子導入ニワトリが卵白中に生産したMHC-アレルゲンエピトープペプチド融合タンパク質（MHC-Crp/Fc）を、スギ花粉症モデルマウスへ経口投与し効能評価したところ、くしゃみ回数ならびに血清中IgE量の有意な減少が観察された。このことから、MHC-Crp/Fc含有卵白がアレルギー治療に有効であることがわかった。また、治療スケジュールを変えることで、より効果的に免疫寛容を誘導できた。TGF-β遺伝子導入ニワトリの卵中に目的タンパク質が生産されていることが確認できた。これらの研究成果を複数の学会に報告した。本年度はおおむね順調に実行することができ、目的を達成することができたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに作製ずみのトランスジェニックニワトリ由来スギ花粉症アレルゲンエピトープ含有卵白およびTGF-β含有卵白を用いて、経口アレルゲン取り込み細胞であるM細胞の誘導をバイオアッセイで評価する。並行して、マウスへの経口摂取投与プロトコールの最適化を合わせて行うことで、腸管免疫系でより効果的に作用する分子改変やアレルギー発症メカニズムの解析を行う。具体的には、ヒト大腸がん由来腸管上皮細胞株Caco-2とヒトBリンパ球腫瘍由来細胞株Rajiのカルチャーインサート培養法によりCaco-2からM細胞様の分化誘導が可能であることから、アレルゲンエピトープ等免疫調節関連タンパク質含有卵白から部分精製物添加を行い、M細胞分化誘導遺伝子マーカーのRT-PCR解析および細胞免染により機能評価を行う。M細胞へ標的化可能なSigma1およびM細胞分化誘導因子RANKLの細胞外ドメイン領域遺伝子をクローニングおよび生産を行う。CHO細胞や大腸菌を用いてM細胞標的型組換えアレルゲンエピトープを生産させ、適切に活性を維持して生産されるかを、ウエスタンブロット法やバイオアッセイ等評価するとともに、目的タンパク質を生産するトランスジェニックニワトリを作製する。
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