2013 Fiscal Year Research-status Report
Phox2b-EYFP及び光感受性イオンチャネル導入ラットを用いた呼吸中枢の解析
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25430012
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
鬼丸 洋 昭和大学, 医学部, 客員教授 (30177258)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Phox2b / EYFP / 中枢化学受容器 / トランスジェニックラット / カルシウムイメージング |
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| Research Abstract |
転写因子Phox2b遺伝子は，CO2感受性を持つ腹側延髄呼吸性ニューロン（pFRG）に特異的に発現する．本研究の目的は，Phox2b遺伝子の発現制御領域下に蛍光タンパク質(EYFP)を発現させたトランスジェニック (Tg) ラットおよび，光感受性イオンチャネルを発現させたTgラットを用いて，延髄呼吸中枢の神経回路の動作特性を明らかにすることにある．25年度は，１）EYFPを指標として，Phox2b発現細胞の胎生期・新生児期における下位脳幹内ニューロンネットワークの三次元構築，２）このTgラットが正常な呼吸中枢神経活動を発生することができるかどうかの検討，３）pFRG領域におけるPhox2b発現細胞の活動パターンのカルシウムイメージングによる解析を行った．
１．胎児期（E12.5）におけるPhox2b発現細胞の発生とニューロンネットワークの構築について解析を行い，EYFPの脳幹部における発現パターンなどを確認した．また新生児期のpFRGにおけるPhox2b発現ニューロンについても，EYFPの分布とPhox2b陽性細胞の分布を比較し，ほぼ重なることを確認した．さらに，新生児期の脳幹において，EYFPを指標としてPhox2b陽性細胞の3次元構造を調べる目的で，脳幹の透明化処理を行い，コンフォーカルレーザー顕微鏡などを用いて解析することを試みている．２．Phox2b-EYFPの発現が確認された新生児ラットから，脳幹－脊髄を摘出し，呼吸神経活動が通常のラット標本と変わりがないこと，また，パッチクランプ法によりpFRGの呼吸性ニューロンから膜電位を記録し，その活動が正常であることを確認した．３．カルシウム感受性色素で標本を染色し，コンフォーカルレーザー顕微鏡下でpFRG領域を吻側断面から観察し，EYFP発現ニューロンの神経活動を記録し，呼吸性活動とどのような相関を持っているかを解析した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Phox2b-EYFP-トランスジェニックラットの基本的性質の解析はほぼ順調に進んでいる．ただし，カルシウムイメージングについては，カルシウム感受性色素Fluo-8の傾向波長とEYFPの傾向波長が近いために，カルシウム感受性色素としてRhod-4を使用して解析を進めている．さらに，EYFPの代わりに，Tomatoを発現するように遺伝子組み換えを行ったラットを作成し，Fluo-8との組み合わせを試みている．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度は，カルシウムイメージングをさらに進展させると同時に，光感受性チャネルを組み込んだラットが作成される予定であるので，光刺激による呼吸ニューロンネットワークの活動パターンの変化の解析を行う．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
2014年3月中旬に行われた日本生理学会（鹿児島）の参加費，旅費の支払い申請ができなかったため．
上記の支払いは今年度行う．
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