2014 Fiscal Year Research-status Report

てんかん発作に及ぼすエストロゲンのHCNチャネルとGluR2制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	25430070
Research Institution	Ohu University
Principal Investigator	関健二郎奥羽大学, 薬学部, 講師 (50342803)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	エストロゲン / てんかん発作 / AMPA受容体 / シグナル伝達系 / HCNチャネル
Outline of Annual Research Achievements	女性てんかん患者の70％以上が経験する月経随伴性てんかんは、月経前のエストロゲン濃度上昇と発作のタイミングが相関する事から、エストロゲンが月経てんかん発作の危険因子と考えられてきた。その作用は細胞実験などにおいても支持されている一方、エストロゲンがてんかん発作後の神経細胞保護作用に関する報告も多い。申請者はこれまで、エストロゲンがHCN1チャネルの細胞内トラフィッキングを誘導し、発作を悪化させる可能性と、AMPA受容体GluR2サブユニットの細胞内トラフィッキングを阻害して神経保護効果を発揮する可能性を追求してきた。申請者は、初年度までに、エストロゲンによるGluR2の細胞内トラフィッキング阻害効果は、発作の閾値とは無関係である一方、発作の持続時間や呼吸麻痺関連死の阻害に関与している可能性を示唆する結果を見出してきた。一方、HCN1チャネルの機能低下の関与については、HCN1チャネルの阻害剤を脳室内に投与して試みてきたが、その関与の同定に至っていない。そこで２６年度には、エストロゲンによるGluR2細胞内トラフィッキング阻害効果がどのような機序を介して生じるのかを中心に検討を行った。その結果、エストロゲン投与群でてんかん発作を誘導したマウスでは、カルパイン（Calpain 1）のタンパク量が顕著に増加していることを見出した。このCalpain 1は、PKAシグナル伝達系の下流に位置するタンパク質で、これがSTEPのユビキチン化を誘導してその活性を阻害する事が報告されている。STEPは、GluR2のチロシン残基の脱リン酸化を阻害し、GluR2の細胞内トラフィッキングを阻害する可能性が報告されているため、エストロゲンによるGluR2の細胞内トラフィッキング阻害効果とてんかん発作後の保護効果に関与している可能性が高い。２７年度に、このカルパインの関与を詳細に検討する予定でいる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 初年度後半に、エストロゲン投与群では、mTORのリン酸化が促進されている可能性を示唆する結果をウエスタンブロット法にて得ていたため、２６年度前半から、mTOR活性化とHCNチャネルの細胞内トラフィッキング促進効果を中心に検討を進めてきた。ところが、mTOR阻害剤であるラパマイシンの脳室内投与は、発作の閾値や発作後の死亡率やHCNチャネルの発現量に影響を与えなかった。エストロゲンによるHCNチャネル阻害効果は、卵巣摘出マウスでは再現性が無いことから、マウスの性周期を特定し、エストロゲンの増加するサイクルごとにmTORの活性化レベルを検討したが、正常マウスでは、mTOR活性の性周期に依存した変化は認められなかった。このことから、エストロゲン投与だけでなく、てんかん発作との組み合わせが重要である可能性が高いため、それを今後検討する予定でいる。さらに、GluR2の細胞内トラフィッキング阻害効果に関しても想定し得る様々因子を候補に挙げ、その中からGLP-1の発現量が、エストロゲンによって変化する可能性を見出した。このGLP-1は、脳内の多くは脳幹の弧束核神経によって合成されているが、海馬や大脳皮質に関しては、ミクログリアで合成分泌されていることを突き止めたが、まだこれらがエストロゲンによるてんかん発作に及ぼす影響を調べるまでに至っていない。またミクログリアで発現しているエストロゲン受容体の種類も同定するに至っていない。一方、エストロゲンによるGluR2細胞内トラフィッキング阻害効果に関しては、カルパインが関与している可能性を突き止めており、この関与の可能性が期待できることから、研究状況を「遅れている」ではなく、「やや遅れている」と判断した。
Strategy for Future Research Activity	H27年度は、以下の２つを中心に検討し、一旦まとめに入る。 ①　今回見出したカルパイン１は、STEP61をユビキチン化し、その働きを不活性化する。そこでこのカルパイン１の活性化が保護効果とGluR2の細胞内トラフィッキング阻害効果に関与しているかどうかを検討する。本実験では、カルパイン阻害剤であるカルペプチンを脳室内に投与し、GluR2のチロシン残基のリン酸化レベルや発作後の致死率がエストロゲン非投与群や投与群と比べ、どの様な変化を示すかを検討する。さらに、STEP61のタンパク量が、エストロゲン投与+てんかん発作群どのような変化を示すか、カルパイン脳室内投与によりどのような影響をうけるかを調べ、エストロゲンによるGluR2細胞内トラフィッキングの阻害効果のメカニズムを追及する。最後に、このSTEP61のタンパク量が、マウスの性周期中、エストロゲン濃度変化のサイクルの影響を受けるかどうか、またこれとてんかん発作レベルと相関するかを調べる。これらが明らかになった場合は一旦ここまでの内容で論文にまとめる予定でいる。 ②　エストロゲンによるHCNチャネルの細胞内トラフィッキング促進効果は、卵巣摘出時には再現が無いことから、エストロゲンの増加によるものではなく、卵巣摘出後の質的変化による可能性は依然高い。したがって、最終年度もHCNチャネルに関しては、性周期期間中のエストロゲン量変化をモニターし、エストロゲンサイクル別に発作を誘導し、その時のHCNチャネル発現量を改めて検討する。改めてエストロゲンによるHCN1チャネルの細胞内トラフィッキングが及ぼすてんかん発作を検討し、最終的にFilamin Aの関与（HCN1チャネルとの結合能など）を示唆できればと考えている。さらに、これらの結合能がエストロゲン周期によって変化するかを免疫沈降法にて検討を行い、発作の閾値との相関を調べる。
Causes of Carryover	前年度、予定していた実験に必要な試薬が、15,283円以上であり、次年度に繰り越すことで、不足分を補って予定通りの実験を行う方が無駄が起こらないと考えたため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度の請求額にプラスし、15,283円よりも高額な試薬（抗体など）を購入し、計画通りに実験を遂行する予定でいる。