家族性筋萎縮性側索硬化症タイプ６におけるRNA代謝異常の分子基盤

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25430080
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Hiroshima Bunkyo Women's University
• Principal Investigator: 藤井 律子 広島文教女子大学, 人間科学部, 教授 (90342716)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: リン酸化シグナル / ＦＵＳ／ＴＬＳ / ＲＮＡ輸送 / ＲＮＡ代謝

Research Abstract

本年度は、TLSのRNA結合領域に結合するタンパク質と家族性ALSタイプ6の発症要因となる特異的な点変異体TLSの会合形成について検討するとともに、点変異体TLSの発現による正常なTLSの標的RNAの細胞内輸送阻害と代謝異常について検討した。
(1) 点変異体TLS蛋白とTLS結合パートナーとの会合体形成の検討
点変異体TLS蛋白を脊髄運動ニューロン由来細胞NSC34細胞に強制発現させたのち、免疫沈降を行い、すでに藤井らが同定したTLS結合パートナー蛋白との会合形成について検討したが、点変異体であっても会合自体は正常に起こっていた。ただし、点変異が見られるTLS蛋白のＣ末には複数のリン酸化コンセンサス配列があるため、リン酸化の状態で会合様式が変化したり、正常な蛋白輸送が阻害される可能性が考えられることから、会合形成に必要と考えられる翻訳後シグナル（リン酸化、メチル化など）について検討中である。
(2)点変異体TLSによるTLS特異的スプライスバリアントmRNAの発現変動
TLS変異体の発現、あるいは運動ニューロンの過興奮によるスプライシング後のTLS標的mRNAの核外輸送阻害とこれらのmRNAの翻訳阻害について検討した。ある種のTLS標的mRNAに関しては核外輸送が阻害されており、その結果として蛋白発現も抑制されていた。一方、TLS標的mRNAの中でも、神経活性に依存性の高い発現を示すNR1サブユニットのスプライスバリアントはmRNAレベルはコントロールと変わらない、或いは増加するが、蛋白レベルでは細胞質内の発現量が低下しているものがあり、mRNAやその部分代謝物が細胞外へ放出されている可能性を示唆する結果を得た。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度計画では、点変異体TLSによるTLS特異的スプライスバリアントmRNAの発現変動
を検討する目的で点変異体TLSのノックインマウスのiCLIP解析を予定していたが、マウス作製（共同研究）に時間がかかっており、本年度は達成できていない。また、蛍光タグ変異体TLS蛋白とカルシウムのダブルイメージングについても、実験設備の不備があり、未だ予備実験段階であり、有意な研究データが得られない状態である。

Strategy for Future Research Activity

点変異体TLSノックインマウスを用いた解析が一時頓挫しているため、当面はNSC－34細胞とTLSノックアウトマウス初代神経培養系を用いて、TLS標的mRNAのスプライスバリアント生成の発現変動を比較検討していきたい。また、TLS標的mRNAのスプライスバリアントの細胞外輸送の機構とそのシグナルの同定も含め、神経変性初期におけるRNA代謝機構については、exosome解析により検討していく方針である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

3月に受け入れ利息90円が入金されたため、本年度（平成25年度）繰越が90円となりました。
次年度、直接経費の物品費に計上し使用する。