2014 Fiscal Year Research-status Report
シグナル伝達と転写制御を結ぶ白血病原因遺伝子TRIB1の解析
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25430121
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| Research Institution | Japanese Foundation for Cancer Research |
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Principal Investigator |
横山 隆志 公益財団法人がん研究会, その他部局等, 研究員 (00535833)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 白血病 / Trib1 / C/EBPα / Bcl11a / 転写因子 / レトロウイルス挿入変異 / ノックアウトマウス / MAPキナーゼ経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Trib1の発現量の違いによる白血病の性質および遺伝子発現の比較を行った．Hoxa9によって不死化した細胞をTrib1 KOマウス由来 (Trib1 null) と野生型マウス由来 (Trib1 low) の造血細胞より作製し，さらにTrib1を強制発現した細胞 (Trib1 high) の三者において比較を行った．ギムザ染色による形態観察をではこれらの不死化細胞は未成熟なmyeloid leukemiaの形態を示すが，Trib1 hiにおいては一部で分化の進行した細胞が見られた．液体培養における増殖を比較したところTrib1 hiの細胞では増殖速度と細胞周期の進行が亢進していた．またTrib1 hiではIL-3刺激後のERK1/2のリン酸化の亢進しており，nullではlow比較してやや減弱が見られた．
この3者においてマイクロアレイによる遺伝子発現解析をおこなった結果，Sox4, Cd44, Msi2 および Kitといった白血病や造血に関与する遺伝子がTrib1 hiのグループで高発現していた．またTrib1 hiにおいて顆粒球分化関連遺伝子の高発現が見られた．さらに GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）においてC/EBPαの標的遺伝子や細胞周期に関与する遺伝子がエンリッチされており， 特にTrib1 hiでCyclinD2, CyclinB1 and Cdk4が高く，一方Cdk inhibitorの発現は低かった．実際にimmunoblottingでタンパク質量を調べた結果，CdK4およびCyclinD1の発現がTrib1 hiで高く，このことがTrib1 hiの増殖の促進に関与することが示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度はBcl11aの解析をおこなったため，本年度は平成25-26年度計画に記載したTrib1 KOマウスを用いたTrib1の発現量の違いによる白血病の性質および遺伝子発現の比較を行った． DNA結合部位の網羅的解析に関してはChIP-Seqを行うためのFLAG-Hoxa9およびC/EBPαのクロマチンIPおよびライブラリーの作製しており，平成27年度研究において次世代シークエンサーによる解析結果を報告できると考えている．
MAPキナーゼ経路における機能については本年度に実施したマイクロアレイ発現解析により検討した．Trib1 nullにおいてはIL-3刺激によるリン酸化ERK1/2の減弱が見られる一方， MAPキナーゼ経路の活性化によって発現誘導される遺伝子セットの発現が高く，ネガティブフィードバックの発現制御が行われている可能性が示唆された．
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| Strategy for Future Research Activity |
Trib1発現量の異なる不死化細胞において，Hoxa9およびC/EBPαのDNA 結合部位の網羅的解析を行う．平成26年度研究において樹立したTrib1 hi, loおよびnullの三者において抗FLAG抗体用いたHoxa9，および抗C/EBPα抗体によるクロマチンIPを行ってライブラリーを作製しており，これらのサンプルを次世代シークエンサーにて解析し，Hoxa9と内在性C/EBPαのDNA 結合領域と比較してTrib1の有無による違いが見られるか調べる．さらに平成26年度研究の発現解析と統合して，Trib1の転写因子の制御について検討する．
平成25年度研究においてTrib1の協調遺伝子であるBcl11aに着目し，野生型およびBcl11a KOマウスの胎児肝由来造血細胞にTrib1を導入して樹立した不死化細胞を用いてマイクロアレイによる発現解析を行っている．Bcl11aはzinc finger型転写抑制因子であることからTrib1/Bcl11aおよびTrib1/Hoxa9導入により樹立した腫瘍細胞を用いてBcl11aのChIP-Seqを行い，DNA結合部位の解析を行う．この結果と平成25年度実施の発現解析結果と統合し，Bcl11aがTrib1によって誘導されるAMLにおいてどのように機能するかを明らかにする．
IL-3刺激によるERK1/2のリン酸化はTrib1 hiで亢進が見られたもののTrib1 nullはlowと比較してやや減弱が見られる程度であり，内在性Trib1のKOによるMAPキナーゼ経路への関与を調べるのは困難であることが考えられた．このことからTrib1強制発現によるMEK1/ERKの結合やMEK1の局在への影響に着目し，Trib1によるMAPキナーゼ経路における機能について検討する．
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| Causes of Carryover |
平成27年4月22-24日にブダペストで開催されるTribbles meeting 2015に参加するため，次年度への繰り越しを行う．本研究結果について演題「The functional role of Trib1 in normal and neoplastic hematopoiesis」においてポスター発表を行い，意見交換を行う．この研究会は本研究で解析を行うTribファミリー遺伝子について最先端の研究に触れることができ，また白血病だけでなく固形がんや代謝，免疫といった他分野のテーマについての知識を得ることが期待できる．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
東京からブダペストへの往復旅費および学会参加費に使用予定．
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Research Products
(3 results)
