新規バイオマーカーAPC結合蛋白EB1の肝細胞癌発癌進展における分子機構の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25430134
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 中西 一彰 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (80374338)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 横尾 英樹 北海道大学, 大学病院, 助教 (70399947) ; 柿坂 達彦 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任研究助教 (40583092) ; 神山 俊哉 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80322816) ; 武冨 紹信 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70363364)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 肝細胞癌 / EB1 / バイオマーカー

Research Abstract

【背景】肝細胞癌株のプロテオミクス解析（蛍光2次元電気泳動法）により正常肝細胞株と比較して高発現してタンパクの一つにAPC binding protein EB1であることを明らかにした。EB1は1995年に大腸癌において腫瘍制御タンパクであるAPCと結合するタンパク質として見いだされた。その後、微小管における動的不安定性を制御するために伸長端へ特異的な局在を示すタンパク質であることが知られその機能は生物種を超えて高く保存されている。EB1は、肝細胞癌臨床検体でも非癌部と比較して癌部で高発現しており、染色強度から独立した予後再発因子となることを示した。このことからEB1は肝細胞癌の生物学的悪性度と強い関係をもつことが示唆されるがその機能についてはほとんどわかっていない。【目的】EB1の肝細胞癌における悪性度との関連を明らかにするため肝癌細胞株を用いEB1とシグナル伝達系との関係を明らかにする。【方法】増殖能の高い肝癌細胞株であるHLEを用いてEB1の発現をwestern blotにて確認する。またsiRNAでEB1の発現を落としproliferation assay, invasion assay, cell cycle assayを行いcharacterの変化を観察する。【結果】HLFからcell lysateを作成し、抗EB1抗体にてwestern blotを行ったところ強発現しており、mRNAも強発現していることを確認した。次にlipofectamine 2000にてsiRNAを行いwestern blotとreal-time PCRにてknockdownしていることを確認した。
これらを使用し、proliferation assayを行うとcell count法、MTS法いずれにおいても2日目以降で有意にEB1の発現を落としたもので増殖能が低下していた。
また、同様にマトリゲルチャンバー法にてinvasion assayを行うとEB1のknock downにより浸潤能も抑制された。【考察】以上の結果からEB1は増殖能、浸潤能と関わっており肝細胞癌の悪性度と強い関係を持つことが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

肝癌細胞株を用いた分子生物学的解析は仮説通り順調に進んでいるものと思われる。強発現系の作成などは多少遅れている。

Strategy for Future Research Activity

１，約250例の肝細胞癌切除例、肝移植例に対してEB1の免疫組織化学染色、Western blotを行い、予後予測マーカーとしての有用性を確立する。
２，同時に増殖、浸潤、転移に関わるシグナル伝達系の変化をみるためにPCR arrayをかけ網羅的に解析する。変化のあるものに対しては個別に解析する。
３，抗EB1抗体による免疫沈降を行い、EB1に結合しているタンパク質を質量分析にてすべて同定する。結合タンパクを同定後、結合タンパクの発現を調節することで肝細胞癌株の挙動の変化をみる。下流のシグナルの変化をPCR arrayで解析する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度使用額が10万以内なのでほぼ順当に使用したと考えている
次年度も引き続き分子生物学的解析のための消耗費として使用する予定である。また学会参加費などにも使用していく予定である。