2013 Fiscal Year Research-status Report

ゲノムワイドRNA干渉スクリーニング法による腫瘍溶解RNAウイルス増殖機構の解明

Research Project

Project/Area Number	25430151
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	井上博之九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (80529967)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	腫瘍溶解性ウイルス / エンテロウイルス / ﾊｲｽﾙｰﾌﾟｯﾄｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ / RNA干渉
Research Abstract	これまで我々は、我々が開発あるいは見出したRNAウイルス（遺伝子改変麻疹ウイルス（MV-NPL）、各エンテロウイルス（CVB3、CVA11）が様々なヒト固形癌細胞株に対し高い殺細胞効果を有することを明らかにしてきた。本実験計画では、新規技術であるハイスループットRNA干渉スクリーニング法（プール型レンチウイルスshRNAライブラリー）を用いた網羅的解析手法により、ヒト癌細胞内でのウイルス増殖に重要な役割を果たす遺伝子（群）を同定し、より安全性及び抗腫瘍効果の高いRNA腫瘍溶解性ウイルス療法の開発を目指すことを目的とする。まず、複数の標準治療抵抗性癌細胞におけるCVA11ウイルスの殺細胞傷害性を検証した結果、標準治療抵抗性小細胞肺癌及び乳癌細胞株にCVA11感染による高い殺細胞傷害性が認められた。次にプール型レンチウイルスshRNAライブラリーを作成し同ウイルスを用いた感染スクリーニング実験を施行し、ウイルス治療抵抗性を示す癌細胞コロニーの存在の確認に成功した。今後は、次世代シークエンス実験を施行し、同実験結果よりウイルス増殖における重要遺伝子を推定し、loss of fuction 及びgain of function実験を施行する予定である。同実験により得られたウイルス増殖機構に関する基礎的知見を基に、今後の腫瘍溶解性ウイルス療法の安全性及び有効性を改善することが期待でき、複数の治療法を組み合わせて行う集学的癌治療戦略の中で、化学療法あるいは分子標的薬等併用の際の選択の際に科学的根拠を付与することは自明でありその研究意義は高い。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason まず、in vitro細胞傷害性試験（クリスタルバイオレット法）の結果、CVA11感染により標準治療抵抗性ヒト癌細胞であるオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞（WiDr）、トリプルネガティブ乳癌細胞(MDA-MB231及びMDA-MB432) 、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ２次耐性小細胞肺癌細胞（H1975）あるいは乳癌幹細胞を含むMCF7細胞に対し、高い殺細胞傷害性を呈した（MOI=0.001～0.1）。次に、ハイスループットRNA干渉スクリーニング法に用いるレンチウイルスshRNAライブラリー（DCIPHER, Human module 1, 5000 gene targerts, 27,500 shRNAs）を293T細胞へトランスフェクションし構築した。作製した上記レンチウイルスshRNAライブラリーを標準治療抵抗性癌細胞（MDA-MB231, H1975）に感染させ遺伝子ノックダウンした後（感染力価：MOI=0.1～0.5）、腫瘍溶解性RNAウイルス（CVA11）を感染させ、腫瘍溶解性に抵抗性を示す癌細胞コロニーが出現することを確認した。尚、ポジティブコントロールとしてレンチウイルスライブラリー未感染癌細胞に同RNAウイルスを感染し腫瘍溶解性を呈することを確認した。現在、各癌細胞において感染力価、感染時間を条件検討中であり、optimized conditionを決定後、癌細胞コロニーを回収し細胞ペレットよりRNAを抽出後、次世代シークエンスによる挿入遺伝子配列を同定する予定である。
Strategy for Future Research Activity	癌細胞コロニーを回収し細胞ペレットよりRNAを抽出後、次世代シークエンスによる挿入遺伝子配列を同定する。異なる癌細胞から得られた遺伝子群の中で、共通する遺伝子を選定し、その中で細胞膜関連蛋白群は除外し（ただし得られた膜蛋白は未知のウイルス受容体であることを強く示唆する）、シグナル伝達経路あるいはその他の細胞質内転写あるいは小器官関連遺伝子群に注目する。次に、siRNA法により同定遺伝子を欠失させた癌細胞の作製、あるいは関連シグナル伝達経路の阻害剤（Loss of function）あるいはリガンド（低分子化合物）（Gain of function）を用いて、ウイルスによる殺癌細胞効果への影響をMTSアッセイや上清ウイスルタイター定量により検証する。得られた知見（CVA11感染増殖に重要な遺伝子）が、肺癌や乳癌細胞以外の癌細胞においても応用できるか否かその普遍性について感染実験により検証する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	ハイスループットRNA干渉スクリーニング法に用いるレンチウイルスshRNAライブラリー（DCIPHER, Human module 1, 5000 gene targerts, 27,500 shRNAs）を293T細胞へトランスフェクションし構築したが、作製したレンチウイルスshRNAライブラリーを標準治療抵抗性癌細胞に感染させ遺伝子ノックダウンした後、腫瘍溶解性RNAウイルス（CVA11）を感染させ、腫瘍溶解性に抵抗性を示す癌細胞コロニー数のバラつきがあり、感染諸条件（MOIや感染時間）の条件検討を要したため、RNA回収後の次世代シークエンス実験を施行できなかったため。癌細胞コロニーを回収し細胞ペレットよりRNAを抽出後、次世代シークエンスによる挿入遺伝子配列を同定する。異なる癌細胞から得られた遺伝子群の中で、共通する遺伝子を選定し、その中で細胞膜関連蛋白群は除外し（ただし得られた膜蛋白は未知のウイルス受容体であることを強く示唆する）、シグナル伝達経路あるいはその他の細胞質内転写あるいは小器官関連遺伝子群に注目する。次に、siRNA法により同定遺伝子を欠失させた癌細胞の作製、あるいは関連シグナル伝達経路の阻害剤（Loss of function）あるいはリガンド（低分子化合物）（Gain of function）を用いて、ウイルスによる殺癌細胞効果への影響をMTSアッセイや上清ウイスルタイター定量により検証する。得られた知見（CVA11感染増殖に重要な遺伝子）が、肺癌や乳癌細胞以外の癌細胞においても応用できるか否かその普遍性について感染実験により検証する。