2013 Fiscal Year Research-status Report

PDIを標的とした難治性固形腫瘍治療薬の開発

Research Project

Project/Area Number	25430165
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所)
Principal Investigator	山田六平地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, その他 (30404974)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宮城洋平地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, その他 (00254194)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	難治性固形腫瘍 / 卵巣明細胞腺癌 / 細胞死
Research Abstract	はじめに参考文献(Shili X, Yamada et al. PNAS 2012)のごとくProtein Disulfide Isomerase (PDI)をsiRNAを用いてノックダウンし、卵巣癌細胞OVCAR8に細胞死が誘導されるかを確認したが再現性が得られなかった。これはsiRNAのoff target効果と考えられた。しかしながらPACMA31と同じアナログであるPACMA5が難治性固形腫瘍である卵巣明細胞腺癌（以下OCCA）に対し高い殺細胞効果を示し下記のごとくPDIを凌駕するようなターゲットが見つかる可能性があることがわかったため研究を継続している。 OCCAの細胞株は既存の抗がん剤に耐性を示し、paclitaxel, cisplatinに対するIC50は10～100μMであった。一方PACMA5はいずれのOCCA細胞株に対してもわずか1μMでほぼ100％の殺細胞効果を示し、有効な治療薬となりうる可能性が示された。また非がん肝細胞、非がん気管上皮細胞に対しては1μMで殺細胞効果を認めなかった。これはPACMA5ががん細胞に選択的な殺細胞効果を有している可能性を示している。この細胞死のメカニズムを明らかにするためにアポトーシス阻害剤の前投与後PACMA5の投与をおこなったが、細胞死は全く阻害されす、非アポトーシス性の細胞死が誘導されていることが明らかとなった。このことはPACMA5が既存の抗がん剤では見られない細胞死を誘導することでがん細胞のみを細胞死に至らしめることを示しており、新たな細胞死のメカニズムを発見できる可能性を示唆するものである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason siRNAによるPDIノックダウン細胞を用いてPDIの発現と細胞増殖能との関連を検討した。siRNA/PDI-OVCAR8細胞はウエスタンブロットにおいてPDIのノックダウンは確認できたが、細胞増殖能はコントロールベクター導入細胞と変わりなかった。そのためPDIは増殖能に寄与しないと判断した。またtissue arrayで膵癌および甲状腺未分化癌におけるPDIの発現と悪性度の関連を調べたが、臨床病期および予後との相関は認めなかった。ここで卵巣癌の中でも既存の抗がん剤に耐性を示す卵巣明細胞腺癌に着目し、5つの細胞株を用いてPACMAの殺細胞効果を調べたところ、いずれの細胞株に対しても著しく高い殺細胞効果を示した。またその細胞死は既存の抗がん剤によって誘導される細胞死とは全く異なる新しい細胞死であることを阻害剤、蛍光色素による染色で確認した。PACMAは現存する抗がん剤に対して難治性である卵巣明細胞腺癌に対する新たな治療薬になりうると考え、研究を進めていく方針である。
Strategy for Future Research Activity	１）PACMAの酵母に対する作用の検証 ①酵母細胞の生育やミトコンドリアの形態と機能を解析する。②得られた表現型が他の酵母株でも見られるかどうかを確認するため、他の株でも同様の実験をおこなう。③PACMA5の作用にミトコンドリアとの関連が認められた場合は、さらに詳細な解析を実行する。２）PACMA5の標的タンパクの解明スクリーニングによる標的タンパクの同定をおこなう。３）卵巣明細胞腺癌腹膜播種モデルに対するPACMAの有効性　自己複製能欠損レンチウイルスRedi-Fect-Red-Fluc-Puromycinで形質導入した株化ヒト卵巣明細胞腺癌細胞を免疫不全マウスに腹腔内移植する。ルシフェリン投与後の発光を小動物蛍光発光イメージング装置(IVIS)でモニタリングすることで腫瘍の成長を評価する。腫瘍が生着した時点で、PACMA５による治療実験を開始する。腫瘍量はの変化はIVISでモニタリングする。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	次年度繰越理由：前述のごとく本研究の主眼は標的としてのPDIの探索および生物学的意味の検討のみならずPACMA投与後の細胞死誘導（ミトコンドリアと中心とした）およびそのメカニズムの解明となった。細胞死誘導の解明にあたり、まず標的タンパクの同定をおこない、その標的タンパクに関連する複数のタンパクを免疫沈降、siRNAで解明する。次年度使用予定：標的タンパク検索および細胞死の解明をおこなうことを目的として免疫沈降抗体、siRNAベクター、shRNAライブラリー,GSH/GSSG-Glo Assay10ml, MitoSox Red 10x50ug, OxiSelect ROS Assay Kit96T, Total ROS/Superoxide Detection kit, Mito Screen JC-1 Kit100T, Mitochondrial,MarkerAntibodySamp.,Mito-TEMPO5mgなどを購入予定である。