2014 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム機能の適正な発現を担うインスレーターと非コードDNAの物理的特性
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25430169
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
坂本 尚昭 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00332338)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | インスレーター / エンハンサー遮断活性 / 反復配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
各種反復配列の物理的特性およびインスレーター活性を解析するために、各種反復配列を人工合成してサブクローニングした。ヌクレオソームを排除する性質を有する(CCGNN)nについては、9リピートおよび18リピートでエンハンサー遮断活性を示すことを示していたが、さらに長い反復配列を作製するために、新しい反復配列の伸長法を確立した。これにより、(CCGNN)n, (CAGNN)n, (CCANN)nリピートについては35リピート、69リピートの作製に成功した。また、トリヌクレオチドの柔軟性についての報告がすでにあるため、10種類のトリヌクレオチドリピートの作製および伸長を行い、概ね終了した。これから、各リピート配列のエンハンサー遮断活性を測定していく。
また、Arsインスレーターのエンハンサー遮断活性にモノヌクレオチドリピート（Gストレッチ）が関与する結果が得られ、またこのGストレッチに結合するタンパク質の存在もゲルシフト分析により明らかとなった。そこで、アフィニティークロマトグラフィーおよび質量分析を用いた解析により、Gストレッチ結合タンパク質の有力な候補としてheterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q-like が同定された。現在、さらに詳細な解析を進めている。
さらに、DNAの動きとヌクレオソーム親和性を弾性ネットワークモデルにより数理シミュレーションするシステムを確立し、ヒト・線虫・ショウジョウバエのゲノムを対象に解析を行った。ヌクレオソームを形成しやすい配列は、ヌクレオソームを形成しにくい(CCGNN)n配列とAT-richなArsインスレーターの中間的な性質を示すことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
エンハンサー遮断活性をHeLa細胞で測定するために、SV40エンハンサー／プロモーターの距離を約2kb離した活性測定系を作製していた。昨年度までこの研究課題の実験を行っていた大学院生が修了し、今年度より新たな卒論生がこれを引き継いだ。しかし、この学生が同じ実験を行ったところ培養細胞系における活性測定が安定せず、今年度はその原因解明および測定系の改変に多くの時間を費やすことになった。また、ウニ胚を用いた活性測定系についても、作製を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは、エンハンサー遮断活性を測定するシステムを再構築して、すでに作製された反復配列がもつエンハンサー遮断活性を測定する。また同時に、各反復配列がもつバリア活性についても測定し、反復配列の役割について検討する。
また各反復配列や、弾性ネットワークモデルにより予想されるヌクレオソームを形成しやすい配列・形成しにくい配列について、実験的にヌクレオソーム形成能やエンハンサー遮断活性を測定し、各種DNA配列が示す挙動とエンハンサー遮断活性との関連について明らかにする。
さらに、Arsインスレーター（Gストレッチ）結合タンパク質の解析をさらに詳細に進め、その同定および阻害によるインスレーター活性への影響について検討する。
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