2014 Fiscal Year Research-status Report
新規なPCNAアンロード機構による細胞周期制御とゲノム維持
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25430171
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
塩見 泰史 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (80380567)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | PCNA / Elg1-RFC / PCNAローダー / PCNAアンローダー / 細胞周期 / ゲノム維持 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度には、RNAi法等によるヒト細胞内での解析で、Elg1-RFCがPCNAアンローダーとして機能していることを明らかにした。当該年度では、Elg1-RFCの細胞内における動態と、精製タンパク質を用いた生化学的解析によりその特性を明らかにすることを目的とした。
細胞内動態については、Elg1-RFCと、PCNAローダーとして機能する他のRFC複合体（RFC1-RFC、Ctf18-RFC）との比較を行った。その結果、Elg1-RFCは他のRFC複合体が溶出する高塩濃度でもクロマチンに結合しており、これはアンローダーとして機能するための特性の１つと考えられた。また、RFC1-RFCやCtf18-RFCはS期細胞においてPCNAと共局在することが示されているが、Elg1-RFCについては、これらとは全く異なる挙動を示した。今後は、これら新しく見いだしたElg1-RFCの動態について、その意義を含めて検討したい。
生化学解析については、組換え精製複合体を得るために当初の目的通りに昆虫細胞発現系での発現と精製を行った。しかし、Elg1は他のRFC複合体とは異なり、昆虫細胞内では非常に分解されやすいことが分かった。そこで、ヒト細胞発現系（Uno et al., Methods, 2012）からの精製に切り替え、発現コンストラクトの構築と、ヒト細胞内での発現チェックをおこなった。その結果、昆虫細胞に比べElg1の安定性が格段に改善された。そこで、パイロット実験としてスモールスケールで精製を行い、複合体を得ることができる精製条件を確立した。これまでに、Elg1-RFCの精製複合体を用いた解析例は報告されていない。そこで現在は、ラージスケールでの精製に取り組んでおり、精製が完了次第、PCNAロード、アンロード活性等の生化学的解析を行い、Elg1-RFCの特性を明らかにしていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Elg1-RFCの精製が当初の予定より遅れたことによる。これは、Elg1が昆虫細胞発現系では非常に不安定であったためである。しかし、ヒト細胞発現系に切り替えることで、Elg1が安定に発現するように改善され、精製のパイロット実験までは実施することができた。
一方、精製Elg1-RFCによる生化学解析に用いるための鋳型DNAとしては、ssDNAを調製し、ビオチンを付加したプライマーから合成によってdsDNAにし、ニッケースやライゲースによってニックの有無をコントロールできる環状DNAをすでに調製済みである。これを用いることで、PCNAロード、アンンロードがどのようなDNA構造特異的に行われるのかといった特性を解析していく準備は整っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定よりElg1-RFCの精製が遅れたものの、すでに改善は行うことができたので、Elg1-RFCの特性について生化学的な解析を行い、他の複合体との比較でRFC複合体ファミリー間の機能の普遍性や特異性を明らかにしていく。
また現在は、Elg1-RFC複合体の細胞内動態の解析の一部として、当初の研究計画にはなかった細胞内での相互作用タンパク質の質量分析の準備も行っており、この計画も進めていくことでElg1-RFCのPCNAアンローダーとしての特異性を明らかにしていく予定である。
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| Causes of Carryover |
研究費用の一部は講座費から支出することができたことと、当該年度に予定していた海外出張を次年度に行うこととしたので、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
海外での国際学会への参加と、新規の物品購入のために使用する。
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