2015 Fiscal Year Annual Research Report
新規なPCNAアンロード機構による細胞周期制御とゲノム維持
| Project/Area Number |
25430171
|
|---|
| Research Institution | University of Hyogo |
|---|
Principal Investigator |
塩見 泰史 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (80380567)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | PCNA / RFC複合体 / PCNAローディング / PCNAアンローディング / Elg1-RFC / 細胞周期制御 / ゲノム維持 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度には精製Elg1-RFCを用いたPCNAアンローディングの生化学的解析、および、DNA損傷修復後のPCNAアンロードの解析を計画していた。
精製タンパク質の解析では、発現系を昆虫細胞からヒト細胞に切り替えることでElg1-RFCをはじめ、RFC複合体ファミリーを安定に得られるようになった。精製Elg1-RFCを用いてこれまでに、ヒト細胞から回収したクロマチン分画からATP加水分解依存的にPCNAをアンロードする、という生化学活性を直接的に示すことができた。また結合解析では、他のRFC複合体とは異なり、Elg1-RFCはPCNAとの結合が弱いという結果を得た。これから、アンローダーであるElg1-RFCはローダーである他のRFC複合体とは異なる特性を持っていることが示唆される。そこで、精製タンパク質による反応再構築系で詳細なPCNAアンローディング機構の解析を続けている。
これまでは、細胞周期S期におけるElg1-RFCのアンロードを前提に解析していたが、PCNAはDNA損傷後の修復過程でもクロマチンにロードされ、修復の完了後にはアンロードされる。この過程でのElg1-RFCの関与を明らかにするため、Elg1をRNAiしたヒト細胞に紫外線を照射し、経時的にクロマチン結合PCNAの変化量を解析していたが、実験的に照射可能な紫外線量が強すぎると考えられ、対象となる通常細胞でもPCNAがアンロードされるポイントを見出せなかったため、実験系の改良が課題となった。
一方で、Elg1をRNAiするとヒストンタンパク質の修飾が全ゲノムレベルで大きく変化しているという新規な現象も見出した。当初の計画にはなかったが、この点について解析を進めるため、CRISPR/Cas9法によりElg1のノックアウト細胞を作成し、Elg1-RFCのヒストン修飾への寄与について解析を進めている。
|
