2014 Fiscal Year Research-status Report
リボソームタンパク質を指標とするアスペルギルス症原因菌の新規系統分類
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25430198
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
佐藤 浩昭 独立行政法人産業技術総合研究所, 環境管理技術研究部門, 主任研究員 (70357143)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢口 貴志 千葉大学, 真菌医学研究センター, 准教授 (60361440)
田中 玲子 千葉大学, 真菌医学研究センター, 助教 (60143319)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 質量分析 / Aspergillus / 真菌 / リボソームタンパク質 / MALDI-TOFMS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、分類の基準となる基準株(type strain)の解析を行った。基準株のゲノムは解読されていないが、前年度に作成したA. fumigatusゲノム解読株のRPの基準質量リストを参照して、基準株のRPの同定及び質量の検証を進め、A. fumigatus同定用の基準質量リストを作成した。A. fumigatusには2種類のゲノム解読株(Af293とA1163)が存在するが、基準株はそれらのうちA1163とほぼ同じRPパターンを示した。次に、A. fumigatus関連菌種である、A. lentulus, A. udagawae, A. viridinutansの各基準株のRPの分析を行った。各菌株から抽出したRPのマススペクトルを比較したところ、一部のRPは共通するが、多くのRPはそれぞれの種に特有の質量を有していることを明らかにし、質量分析法により、これらの識別が可能であることを実証した。
本法が薬剤耐性株の識別に適用できるか検証するために、千葉大学真菌医学研究センターが保有するA. funigatusの薬剤耐性株の分析を行った。しかしながら、これらのRPのマススペクトルは基準株のものと一致し、種の同定には十分に適用できるが、今回用いた突然変異による薬剤耐性株の識別には適さないことが分かった。
試料菌株の前処理法をさらに改良するために、培養法の違いが及ぼすマススペクトルへの影響について検討した。その結果、培養法の違いにより、菌体破砕液のマススペクトルパターンは大きく異なるため、そのままでは同定は困難であること、液体振とう培養が最も多くRPを発現すること、しかしRPを精製すればいずれの方法でも同定可能であることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の平成26年度計画であるA. fumigatus関連菌種の基準株のRPの分子量リストの作成について、計画書記載のA. fumigatus, A. lentulus, A. udagawae, A. viridinutans各基準株のリストを作成した。これらの菌株の質量分析は順調に進んだ。A. fumigatus基準株や薬剤耐性株は、ゲノム解読株A1163株とほぼ同じRPのパターンを示し、Af293株とは異なることを明らかにした。このように真菌の種の同定と株のタイプ分けができ、本法の有効性を実証することができた。また、これまで識別が困難であったA. lentulus, A. udagawae, A. viridinutansが本法により容易に識別できることを実証した。以上の成果の一部は、質量分析を用いた微生物の迅速分析が話題になっている国際質量分析にて発表した。これまでバクテリアに限定されていた質量分析法による微生物分析を真菌に拡張したことについて、参加者から高い評価を得た。
なお当初の計画では、A. lentulus, A. udagawae, A. viridinutansのRPの詳細な検証（配列や翻訳後修飾の検証など）まで行う予定であったが、これらのゲノム解読結果が近日中に公開されるという情報を得たため、この検証作業をいったん中断した。その代わり、平成27年度予定のA. fumigatus保存株の分析の予備検討を行った。これらの菌株は突然変異により薬剤耐性を獲得した菌株であり、遺伝子解析法でも識別できなかったものであったため、RPに変異が生じていなかったものと思われる。そこで、平成27年度はb-tubulin遺伝子などに変異が生じることが報告されている菌株を中心に解析を進めるという方針を打ち出すことができた。
以上のように、若干の計画変更があったが、研究計画全体への影響はなく、順調に研究が進捗しているものと自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度(H27年度)は、A. lentulus, A. udagawae, A. viridinutansの検証を行ってリストを完成させる。これらのゲノム情報は近日公開される予定であるが、公開が遅れた場合はドラフト配列を入手できる見込みであり、研究進捗への影響はないと考えている。ゲノム解読でRP遺伝子の配列が完全ではない箇所については遺伝子解読を行うなどして、RPの基準質量リストを完成させる。つぎに千葉大真菌医学研究センターに系統保存されているA. fumigatus関連菌種約50株のタイピング分類を行う。さらに、b-tublinなど3種類の遺伝子に基づく系統分類結果、これらは５つのクラスターに系統分類され、分生胞子の形状や抗真菌薬剤に対する感受性などが異なることが報告されており、このような分類結果と、本法による分類結果を比較検証し、本法の分類感度や特徴あるいは限界を明らかにする。b-tublinとRPは、いずれもハウスキーピング遺伝子であり、大まかな分類結果はほぼ同じになり、約30種類のRPを指標に用いる本法のほうが分類感度は高いと予想している。しかし、予想に反して異なる分類結果が得られた場合は、分子系統分類の専門家とその理由を検討し、RP遺伝子の分子進化の観点から本法の特徴を考察する。一方、予想通りに分類を行うことができ、特に抗真菌薬剤耐性との関係を見出すことができた場合は、臨床検体の解析にも挑戦し、医療現場での実用化を目指した研究ステージへの準備を進める。以上の成果をまとめ、アスペルギルス症原因菌の迅速分析法の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
平成26年度は、A. lentulus, A. udagawae, A. viridinutansのRP遺伝子の配列を検証するために、シーケンスや電気泳動分離などの実験を計画していた。しかし、これらの菌株のゲノム解読計画が進んでいるとの情報を得て、近日中に配列データが入手できる可能性が考えられたため、これらの実験を延期し、平成27年度に実施することにした。これらの実験で必要とする物品の購入を延期し、次年度に使用することにしたため、約50万円の差額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成26年度に延期していた、A. lentulus, A. udagawae, A. viridinutansのRP遺伝子の配列検証および不十分な配列について再解読を行うために必要な物品を購入する。それ以外は、当初の予定通り執行する。
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