2013 Fiscal Year Research-status Report

卵母細胞形成と発生において翻訳機構が果たす役割と分子機構の解明

Research Project

Project/Area Number	25440001
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	小谷友也北海道大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (70419852)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	卵母細胞 / 卵形成 / 翻訳 / Cyclin B1 / RNA顆粒 / シス因子 / トランス因子 / 脊椎動物
Research Abstract	遺伝子機能を部位・時期特異的に制御するために、翻訳は特に重要な役割を持つ。しかし、解析技術が限られているためその生物学的意義および分子機構の解析は困難である。我々は、核内から始まる翻訳機構を再現し、なおかつ細胞内において翻訳が起こる部位と時期をリアルタイムで可視化する画期的な技術を独自に確立、翻訳機構研究の新規局面を切り開いてきた。本研究は、生物種を越えて保存される cyclin B1 翻訳機構について、その分子機構と個体発生・生殖細胞形成における役割の解明を目的とする。平成２５年度において、BAC を用いた cyclin B1 変異体の回復実験を次の手順で実施した。はじめに、BAC における cyclin B1 遺伝子のコード領域に TC タグ・ペプチド鎖をコードする配列を相同組替えで組込んだ。次に、BAC におけるベクター配列に Tol2 トランスポゾン配列を相同組替えで組込んだ。作製した BAC を Tol2 転移酵素と同時にゼブラフィッシュ受精卵に微量注入し、ゲノムへの挿入を行った。現在、微量注入したゼブラフィッシュ個体を２００匹程度飼育しており、次世代が得られ次第、生殖細胞への遺伝子挿入の有無をスクリーニングする。つぎに、cyclin B1 mRNA を可視化するために BAC の組替えを推進し、cyclin B1 遺伝子の3'非翻訳領域に MS2 蛋白質結合配列を相同組替えで組込んだ。このレポーター mRNA を蛍光標識するため、GFP 融合 MS2 蛋白質を発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを作製した。さらに、アクチン結合蛋白質 Moesin を GFP/RFP 蛋白質と融合し、この融合蛋白質を発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを作製した。GFP/RFP 融合 Moesin によって、アクチン繊維が可視化されることを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason BAC を用いた遺伝子組換えは容易ではなく、本研究においても必ずしも順調に目的の配列を組み込むことができた訳ではなかった。しかし、最終的に目的の配列を組み込むことに成功し、トランスジェニック・フィッシュ作製に大きく前進したといえる。一方、RNA 分子を蛍光標識するための GFP-MS2 を発現するゼブラフィッシュと、アクチン繊維を蛍光標識するための GFP/RFP-Moesin を発現するゼブラフィッシュの作製はすでに成功した。RNA 分子の挙動、翻訳の活性化、アクチン繊維の動態を同時にリアルタイムで解析するための準備は確実に進んでいる。BAC を持つゼブラフィッシュの作製と、変異体における回復実験に成功していないため、上記の評価とした。
Strategy for Future Research Activity	BAC を用いた cyclin B1 変異体の回復実験を次の手順で推進する。微量注入したゼブラフィッシュ個体を掛け合わせ、生まれた稚魚からゲノムDNAを精製する。PCRによってゲノムに遺伝子が挿入されたことを確認する。得られたトランスジェニック・ゼブラフィッシュを cyclin B1 変異体と掛け合わせ、変異体の表現型が BAC の挿入によって回復するか解析する。つぎに、cyclin B1 mRNA を可視化するために、MS2 蛋白質結合配列をもつ BAC をゼブラフィッシュゲノムに挿入、同様に挿入の有無をスクリーニングする。レポーター mRNA を GFP 融合 MS2 蛋白質によって蛍光標識し、卵形成・卵成熟・初期発生過程における RNA 分子の挙動を詳細に解析する。GFP/RFP 融合 Moesin によって蛍光標識されたアクチン繊維の動態を時空間において高解像度で解析する。RNA 分子・翻訳の活性化・アクチン繊維を同時に可視化し、これらの現象が時空間においてどのように進行するのか、その実態を捉える。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	平成２５年度において使用する試薬の一部に前年度からの在庫が存在し、新たな購入に遅れがあったため。平成２６年度の研究実施に必要な試薬を購入する。