2014 Fiscal Year Research-status Report
新規一分子計測のためのガラス基板の作製とDNA結合蛋白質研究への応用
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25440008
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
韓 龍雲 京都大学, 物質-細胞統合システム拠点, 助教 (50566297)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 蛍光１分子イメージング / DNA結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エピジェネティクス制御、特にメチル化DNA維持機構に大きく関与するヘミメチルCpG結合蛋白質であるヒトUHRF1とゲノム構造維持に重要な働きを示す大腸菌UvrD DNAヘリケースやRuvAB蛋白質の機能を蛍光１分子イメージング技術を用いて解析を行っています。UHRF1についてはヘミメチルCpGの探索過程を明らかにできるように、UvrDについてはUvrDの加水分解とDNA unwindingの連関関係を明らかにできるように、RuvABについてはRuvBの６量体リング構造を二本鎖DNA上で形成する過程を明らかにできるような研究を行っています。しかしながら、本研究で研究対象となる蛋白質はそれぞれDNAやATPとの解離定数が数百nMから数十μMと非常に高く、従来の蛍光１分子イメージング技術では解析が非常に困難でした。本研究では解離定数の非常に高いサンプルでも蛍光１分子イメージングを可能とするナノ開口基板を自らの手で作製し、作製したナノ開口基板を用いて、研究を行いました。これまでに蛍光標識されたUHRF1のヘミメチルCpG結合ドメインであるSRAに関する結果とRuvBに関する結果が得られました。
SRAに関しては昨年に引き続きまして、DNAとの結合活性を調べています。その過程でSRAはヘミメチルCpGを含む二本鎖DNAだけでなく、メチル化シトシンを含む一本鎖DNAに対しても高い親和性を示すという結果が得られました。RuvBに関しては６量体リング構造形成に関して、ATPの結合だけでなく、加水分解が非常に重要な働きを示すことを示唆する結果が得られました。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SRAに関する研究では、これまでSRAはヘミメチルCpG結合につきましては、その活性が詳しく調べられていましたが、本研究ではSRAはヘミメチルCpGだけでなく、メチル化シトシンを含む一本鎖DNAに対してもヘミメチルCpG同様の親和性を持つことを示唆する結果を得ました。
また、研究計画のように穴の直径が70 nmのナノ開口基板作製に関しては、本年度ではこのような基板が大量に作製する必要があるため、昨年度までのように、カバーガラス型の石英ガラス基板に電子線描画するのでは無く、直径が10 cmのウェハ型の石英ガラス基板を用いて、ナノ開口基板を作製することを開始しました。ほぼ作製手法が確立した考えています。
また、RuvBに関する結果につきまして、この２、３ヶ月で論文投稿に進めることができる状態です。
以上、平成２６年度は研究計画に近い形で研究が達成したと考えていますので、おおむね順調に進展していると自己評価しました。
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| Strategy for Future Research Activity |
SRAに関する研究につきましては、SRAと相互作用することが知られているDNAメチル基転移酵素であるDNMT1がSRAとヘミメチルCpG DNA複合体の安定性にどのような影響を及ぼすのかを明らかにするため、これまでの研究から引き続き、DNMT1とDNMT1中のSRAと相互作用するドメインであるRFTドメインの２つの蛋白質を準備し、ナノ開口基板上で形成されたSRA-DNA複合体上にDNMT1またはRFTを加えることで、SRA-DNA複合体がどのような影響を受けるのかを調べる予定です。
RuvBにつきましてはATP存在下での６量体リング構造形成過程を実時間で観察するため、ナノ開口基板にシリンジポンプで送液可能となるような改造を行い、二本鎖DNA上でのRuvBの６量体リング構造形成過程を観察する予定です。
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| Causes of Carryover |
当該年度では研究に必要な蛋白質やDNA等の生体分子の精製や作製のためとして、主に研究費を使用する予定でしたが、研究が順調に進み、論文作成をメインにしていましたので、生体分子の準備の為に試薬代等を使用する必要がなくなった為、次年度使用額が生じました。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は大量にナノ開口基板を作製する予定です。その為、ウェハ型の石英ガラス基板を購入する予定です。また、ナノ開口基板作製のため、京都大学ナノテクノロジーハブ拠点の電子線描画装置の使用する予定ですが、その使用料が非常に高額な為、繰り越された次年度使用額相当の研究費はウェハ型石英ガラス基板購入を含めて、新たなナノ開口基板作製のために使用する計画です。
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Research Products
(7 results)
