2014 Fiscal Year Research-status Report
DNA損傷応答によりDNA複製フォークの進行をスローダウンする機構の解明
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25440009
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
秋山 昌広 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (80273837)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNA複製 / DNA複製フォーク / 複製装置 / 分子マシナリー / DNA損傷応答 / SOS応答 / チェックポイント / DNAコーミング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．複製フォークの進行が細胞の平均DNA合成量へ与える影響：
平成25年度の研究で、複製装置の変異細胞では複製フォークの速度が減少しても、複製開始のタイミングを調節して、細胞体積あたりの平均DNA合成量が野生型と同等であることを見出した。一方、SOS応答を発現している細胞ではrecAとdinB遺伝子の発現により、複製フォークの速度が減少する。この細胞のDNA合成を詳細に解析したところ、平均DNA合成量は野生型にくらべて減少していた。これは、SOS応答では複製開始タイミングを調節する機構が働かず、DNA複製が遅くなることでDNA損傷によるストレスに対処している可能性を示している。
２．recAによる複製フォーク進行のスローダウン機構：
これまでに、LexAリプレッサーの欠損株 (ΔlexA) によってSOS応答を誘導した細胞で、recAとdinB遺伝子の発現上昇によって複製フォークの速度が減少することを明らかにした。recA441変異を持つ細胞は42度で培養すると、一本鎖DNAへのRecA結合が促進されて、RecAタンパク質がDNA損傷ストレスなしで活性化されてSOS応答を誘導する。この変異をeCOMB細胞に導入して (recA441株）42度で培養して、DNAコーミングを用いたeCOMB法で複製フォークの進行を調べたところ、その速度はΔlexA株と同等に低下していた。さらに、RecAの活性化によって切断されないlexA51変異をrecA441株に導入すると、複製フォークの速度は野生株並みに回復した。これらの結果から、recAの活性化は複製フォークの速度低下に直接必要ないことがと明らかとなった。
３．これらのΔlexAおよびrecA441株の解析結果をまとめて、国際科学雑誌に論文を発表した。
４．さらに、dinB遺伝子によりコードされる酵素の活性を解析して、国際科学雑誌に論文を発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度の研究では、recA、および、dinBが複製フォーク進行をフローダウンする機構を遺伝学的または生化学的な手法で解明することを目指した。
（１）recA441変異をeCOMBに導入して、eCOMB法で複製フォークの進行速度を解析した。そして、一本鎖DNAに結合する活性について、複製フォーク進行の調節との関係を始めて明らかにできた。生化学的なアプローチについては、試験管内で再構成した複製フォークの実験系にRecAタンパク質を加えるために、RecAタンパク質を準備できた。
（２）dinBについては、プラスミドを用いたdinB遺伝子の発現系を使用して、変異dinB遺伝子をSOS応答レベルにeCOMB細胞で過剰発現して、eCOMB法で複製フォークの進行速度を解析することを計画した。平成26年度では､多様な変異型のDNAポリメラーゼIVを過剰発現できるプラスミドを準備できた。
（３）recAとdinBにより複製フォーク速度の低下した細胞では、DNA合成が低下していた。これにより、SOS応答では、複製フォークの進行を制御してDNA複製を遅延していることを明らかにした。
変異型のrecA遺伝子を用いた細胞の複製フォーク速度の解析は順調に進展した。試験管内でのRecAタンパク質による複製フォーク阻害の解析、および、変異型のDNAポリメラーゼIVをコードする遺伝子を用いた細胞の複製フォーク速度の解析は準備まで進んだ段階であり、やや計画よりも遅れている。これは、計画自体に不都合を生じたためではなく、これまでの成果を論文に発表するために、当初計画していなかった実験（SOS応答時のDNA合成量の測定実験など）に取り組んだためである。これらの点から、本研究は概ね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．recAが複製フォーク進行をフローダウンする機構：
（１）試験管内で再構成した複製フォークの実験系にRecAタンパク質を加えて、複製フォークでのDNA合成を調べる。まず、野生型のRecAを再構成系に加えて、DNA合成量を調べる。阻害がみれらた場合、RecAが作用してる複製タンパク質を特定する。
（２）変異recA遺伝子をSOS応答レベルにeCOMB細胞で過剰発現して、eCOMB法で複製フォークの進行速度を解析する。変異遺伝子では、RecAの生理活性に重要なATPaseなどの酵素活性の欠損に注目する。
２．dinBが複製フォーク進行をフローダウンする機構：
変異dinB遺伝子をSOS応答レベルにeCOMB細胞で過剰発現して、eCOMB法で複製フォークの進行速度を解析する。DNAポリメラーゼ活性の欠損や、複製フォークへの局在活性の低下した酵素をコードする変異dinB遺伝子に注目する。
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| Causes of Carryover |
実験計画が一部予定通りに進行しなかったため、その解析に予定していた経費を平成27年度の研究に使用する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度に繰り越した経費は、平成26年度に完了しなかった実験計画を平成27年度に遂行するために物品費（消耗品の購入）に充てる。
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Research Products
(10 results)
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[Presentation] A single molecule approach to DNA replication in Escherichia coli cells demonstrated that DNA polymerae III is a major determinant of fork speed2014
Author(s)
Pham, TM., Tan, K.W., Sakumura, Y., Okumura,K., Furukohri, A., Maki, H.,and Akiyama, T.M.
Organizer
The 9th 3R International Symposium
Place of Presentation
御殿場高原ホテル（静岡県、御殿場市）
Year and Date
2014-11-11 – 2014-11-21
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[Presentation] Escherichia coli DNA polymerase IV mediates quick recpovery of repliaction forks stalled at N2-dG adducts.2014
Author(s)
Furukohri, A., Ikead, M., Akiyama, M., Katayama, T., Fuchs R.P., and Maki, H.
Organizer
The 9th 3R International Symposium
Place of Presentation
御殿場高原ホテル（静岡県、御殿場市）
Year and Date
2014-11-11 – 2014-11-21
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[Presentation] A single molecule approach to DNA replication in Escherichia coli cells demonstrated that DNA polymerae III is a major determinant of fork speed2014
Author(s)
Pham, TM., Tan, K.W., Sakumura, Y., Okumura,K., Furukohri, A., Maki, H.,and Akiyama, T.M.
Organizer
DNA polymerases: Biology, Diseases and Biomediacal Appliatiuon Conference 2014
Place of Presentation
Robinson collage (Cambridge, England)
Year and Date
2014-08-31 – 2014-09-04
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[Presentation] Escherichia coli DNA polymerase IV mediates quick recpovery of repliaction forks stalled at N2-dG adducts2014
Author(s)
Furukohri, A., Ikead, M., Akiyama, M., Katayama, T., Fuchs R.P., and Maki, H.
Organizer
DNA polymerases: Biology, Diseases and Biomediacal Appliatiuon Conference 2014
Place of Presentation
Robinson collage (Cambridge, England)
Year and Date
2014-08-31 – 2014-09-04
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