2013 Fiscal Year Research-status Report
ヒト細胞複製フォーク３DNAポリメラーゼモデルの生化学的検証
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25440011
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
釣本 敏樹 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (30163885)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 複製フォーク / DNAポリメラーゼ / in vitro 複製 |
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| Research Abstract |
精製されたヒトの複製フォークの主要な構成因子を組み合わせて、機能的な真核生物型複製フォークの構築をすることでヒト複製フォークの反応過程を３種の精製DNAポリメラーゼで再現し、複製フォークの進行が３DNAポリメラーゼで行われることの生化学的検証を目的とする。
これまでに必要な３種のDNAポリメラーゼ、α、δ、εの精製標品を確保している。これらに加えて再構築に必須な因子として、CDC45、MCM2-7、GINS複合体で構成される複製フォークの駆動DNAヘリカーゼCMG複合体の発現と精製をめざした。必要な11種のcDNAを発現ベクターに組み込み、ヒトの293T細胞で高効率の一過性発現を行った。この結果、各因子の発現が確認され、MCM2-7、GINSについてはこれらの構成単位として精製可能であることが示された。CDC45については、発現効率が低く、単独での精製にはいたらなかった。さらに11種にタンパク質の同時発現では、タグ抗体ビーズによる共沈降実験で、すべてのタンパク質が共沈降することが確認され、CMG複合体が再構築されていることが確認された。しかし、複合体に組み込まれているのは、発現タンパク質の数パーセントと考えられ、複合体の精製が容易でないと予想された。
SV40T抗原駆動型複製フォークの解析については、粗抽出液と鋳型DNAビーズを用いた複製反応の予備実験段階まで進んでいる。精製DNAポリメラーゼδ、εを使った解析ついては、プライマー/一本鎖DNA基質でのPCNA依存的DNA合成活性の検討を行い、それらの合成効率を比較した。両DNAポリメラーゼ存在下でのDNA合成の検討をこれから行うところである。
平行してヒトゲノムの一部を組み込んだ長大鋳型DNAの調製を行っているが、構造安定性に問題があり、今後、調製法、用いるDNAの構造の検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CMG複合体の再構築に関しては、発現系ができ、複合体形成の確認まで進められ、精製、ヘリカーゼ活性の確認に至っていないが当初の予定を概ね達成した。しかし、精製標品を得る点で、CDC45の低発現がネックになり、今後の改善が必要である。
SV40T抗原駆動型複製フォークの解析については、反応系はできているが、実際の反応を行った解析にまだ着手しておらず、達成度としては若干不十分である。
長大鋳型DNAの調製については、ヒトゲノム40kbを組み込んだプラスミドが、予想外に大腸菌で不安定で、調製にてこずっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
CMG複合体の再構築の改善については、発現の低いCDC45については蛍光タンパク質の融合タグを連結して、発現のモニターをしつつ、ベクターの改善を検討する。また、現状の発現系においても、発現スケールを大きくして含まれる少量のCMG複合体の精製を試みる。
SV40T抗原駆動型複製フォークの解析は、粗抽出液を使った反応の解析を本格的に進め、フォークでのDNAポリメラーゼの同定を行う。精製したSV40 T抗原ヘリカーゼとDNAポリメラーゼを用いた反応の再構築は26年度に解析を行う予定である。
長大鋳型DNAについては、20kb程度のより安定で調製の容易なDNAから解析を進め、段階的により長いDNAに着手する方法に切換える予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
SV40T抗原駆動型複製フォークの解析に遅れが生じたこと、長大鋳型DNAの調製に問題が生じたこと、にともない、それらに使用する予定の経費、特に放射性同位元素、細胞培養培地等の経費の支出がほとんどなかったため。
SV40T抗原駆動型複製フォークの解析を本格的に進め、長大鋳型DNAの調製の研究方策を取り入れることにより、研究計画の遅れを取り戻すことに積極的に取り組むために使用する予定である。
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