2013 Fiscal Year Research-status Report
鳥インフルエンザウィルスの種特異的な標的分子の同定を目指した鳥類組織の糖鎖解析
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25440014
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鈴木 詔子 東京大学, 新領域創成科学研究科, 特任研究員 (50401237)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 糖鎖 / 組織 / グライコミクス / 糖タンパク質 / 糖脂質 / 感染症 / 質量分析 |
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| Research Abstract |
インフルエンザウィルス（IV）は、表面上に発現するヘマグルチニン（HA）を介して宿主細胞上の糖鎖を認識し感染する。自然宿主であるカモに感染するカモIVは、腸管に常在し病原性を示さないが、家禽であるニワトリへの感染能を獲得したニワトリIVは、全身に感染する。トリIVの発現するHAは、いずれもSiaα2-3Galという配列を非還元末端側に含む糖鎖構造を認識することが知られている。しかし、詳細な解析では、カモHAとニワトリHAでさらに内側の糖鎖配列の違いにより親和性が異なるという報告がある。この認識する糖鎖配列の違いを生じさせるメカニズムを解明するため、本研究では第一段階として、宿主である鳥類の組織中の糖鎖解析を行い、比較することを試みた。
まず、各種鳥類の組織をポリトロンおよび超音波破砕機を用いてホモジナイズし、クロロホルム／メタノールを用いて脂質を抽出除去した後、沈殿物として残ったタンパク質を変成剤であるグアニジン塩酸塩により可溶化した。このタンパク質を還元アルキル化してから変成剤など低分子化合物を透析除去した後、トリプシンおよびキモトリプシンでペプチドおよび糖ペプチドに分解し、固相抽出法によりペプチド／糖ペプチド画分を分離した。N型糖鎖は酵素を用いて、O型糖鎖はアルカリ還元分解法により切り出し、イオン交換、固相抽出などを用いて精製した。さらに、メチル化した糖鎖をMALDI-TOF-MSにて解析し、プロファイルを作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究を遂行する上で糖鎖構造解析に関して留意すべき点は、下記に示すように３項目ある。今年度は、糖鎖解析において生じるこれらの問題点を克服するため、技術的な基盤固めを集中的に行った。
1. 組織や細胞から糖鎖を精製する場合：組織や細胞から糖鎖を直接精製して質量分析を行うには、タンパク質、核酸、脂質をはじめとした様々な夾雑物を効率よく除く必要がある。このため、既に精製されているタンパク質から糖鎖を切り出し分析する方法に比べ、夾雑物の性質に応じた精製方法を工夫する必要がある。本研究においては、糖鎖の精製法として、イオン交換法や固相抽出法の他、親水性相互作用、カーボンカラムを用いた手法を組み合わせ、サンプルの量や精製の状態に合わせた方法を考案した。
2. メチル化の条件検討：メチル化した糖鎖を用いた分析法は、質量分析を行う際に感度を上昇させるのみでなく、MS/MS法におけるフラグメントパターンから糖鎖の分岐構造を推測する上でも有用な優れた手法である。一方で、強アルカリ条件下で行うメチル化反応には常に副生成物を生じるリスクが伴う。この副生成物の産生を最小限に抑える条件を検討した。
3. 未知で想定外の糖鎖構造が発現されている場合：脊椎動物に発現されている糖鎖の構成単糖は主に、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、シアル酸（N-アセチルノイラミン酸、N-グリコリルノイラミン酸など）、およびフコースで、さらに硫酸化修飾されている場合もある。鳥類組織中の糖鎖もこの場合に準ずると考えられるが、哺乳類には存在しないような予想外の構造も存在する可能性がある。その場合も考慮して、上記の1、2に示したように夾雑物の混入や副生成物の産生を極力抑え、微量でも高感度に糖鎖を検出できるような条件を検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はまず、引き続き質量分析法により鳥類の各種糖鎖構造の解析を行い、その完成を目指す。手法としては、MALDI-TOF-MSにより大まかな糖鎖構造のプロファイリングを行い、さらにMS/MS法により得られたフラグメントのパターンから糖鎖構造の詳細な解析を行う。その情報に基づいて、各種糖分解酵素を糖鎖に作用させ、さらに質量分析を行う。この作業を繰り返すことによって推定された糖鎖構造の確認を行い、鳥類種間あるいは組織間における糖鎖構造の相違を比較する。
次に得られた鳥類組織中の糖鎖構造の種類や特徴に基づき、組織中に存在する糖転移酵素や糖鎖関連酵素の同定を行う。予想される酵素としては、シアル酸転移酵素の他、フコース転移酵素や硫酸化酵素がある。あるいは、得られた糖鎖構造によっては、哺乳類には存在しない新たな糖転移酵素の存在も示唆される可能性もある。その場合には、発現クローニング法などによる新規の糖鎖関連酵素遺伝子の同定を試みる。
さらに得られた鳥類の糖転移酵素遺伝子を用いて、鳥類組織中に存在する糖鎖構造を反映した糖鎖ライブラリーの構築を行う。この糖鎖ライブラリーを用いて鳥インフルエンザウィルス由来のヘマグルチニン（HA）と高い親和性を示す糖鎖構造を同定する。手法としては、固相化したHAに対して蛍光標識をした糖鎖を作用させその親和性を定量する方法を用いる予定であるが、糖鎖の固相化が容易に可能な方法が開発されれば、糖鎖アレイを用いた方法も併用したい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度は、糖鎖構造解析の手法確立を主に行い、消耗品の購入は比較的少なかった。使用機器の維持や管理に必要な消耗品の購入をする必要も本年度は生じなかったため、次年度に使用する予定である。
糖鎖構造解析、糖転移酵素遺伝子のクローニング、インフルエンザウィルスの調製、および分析機器の維持に必要な消耗品などの購入に使用する。また、共同研究者との打ち合わせや研究遂行に必要な情報収集のための旅費に使用する予定である。
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