2013 Fiscal Year Research-status Report
シャペロニン反応メカニズムの再検証：円順列変異型ＧｒｏＥＬの構造・機能解析
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25440026
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
溝端 知宏 鳥取大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50263489)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | シャペロニン / ストップト・フロー解析 / 円順列変異 / フォールディング |
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| Research Abstract |
大腸菌のシャペロニンGroELが変性蛋白質のフォールディングを補助する分子メカニズムを詳細に解析するため，円順列型GroEL変異体CP86-C4を中心に解析を進めた。平成25年度はCP86-C4変異体，および以下に示す2種類のGroEL変異体を用いて，シャペロニンの分子メカニズム理解に寄与する結果を得ることに成功した。
１．配列特異的蛍光ラベルを用いたCP86-C4変異体の標識，機能変換：FlAsH-EDT2はCCXXCCという4つのシステインからなる配列を特異的に認識し，結合する蛍光色素である。本研究ではGroEL CP86-C4がポリペプチド鎖末端をまたいでこれに類似した配列を持つことに注目し，FlAsH-EDT2を用いてポリペプチド鎖末端を連結することを試みた。実験の結果，FlAsH-EDT2がGroEL CP86-C4を特異的に修飾することを確認し，さらにこの修飾はGroEL CP86-C4の機能変換を伴うことも突き止め，FlAsH-EDT2を用いたGroEL CP86-C4の新たな機能改変メカニズムを見いだすことができた。
２．GroEL変異体を用いたストップト・フロー解析： GroELが本来示すATPase活性を大幅に抑制させた変異体を蛍光ストップト・フロー法により解析した。実験の結果，ATPase活性を抑制したGroEL D398A変異体のサブユニット構造変化はある特異的な構造変化において野生型と異なった挙動を示し，この違いがD398A変異体の機能の違いと連動していることが示唆された。
３．新規GroEL変異体の作成と機能評価：「ATPを全く消費しないが，変性蛋白質を野生型GroELとほぼ同等の能力で補助する」変異体を作成し，その評価に着手した。この変異体はシャペロニンの分子メカニズムに新たな視点を提供してくれるものと期待している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究課題申請時にはGroEL CP86-C4変異体に蛍光トリプトファンを導入し（CP86-C4-RW変異体），前課題の実績に上乗せする形で研究を遂行することを想定していたが，この新しい変異体の細胞内発現量が当初期待より低く，ストップト・フロー解析に着手できないでいる。一方，FlAsH-EDT2という配列特異的な蛍光ラベルをオリジナルのCP86-C4変異体に導入することに成功し，しかも修飾により変異体の新たな機能改変を確認できたため，平成26年度はこの修飾型CP86-C4変異体を利用して蛍光ストップト・フロー解析と機能解析を実施する目処が立っている。
また，2年目以降の研究計画として構想していたGroELの他の変異体を用いたメカニズム解析は想定したペースよりも早く着手することに成功し，また得られるデータは円順列変異体により得るデータを補完する大変興味深いものであった。そして，これまでに確認されていない，全く新たな性質を示すGroEL変異体の作成と評価にも本格的に着手しており，より一層詳しくシャペロニンメカニズムを解析するための道具が整いつつある。
以上より，完全に当初の計画通りではないが，良い意味での想定外のデータも含む，多角的な成果を得ている現状をおおむね課題を順調に進めているものととらえている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度は当初の研究計画を修正しつつ引き続き円順列変異体，および各種GroEL変異体の解析を通してシャペロニンの分子メカニズムを詳細に解析していく。主な研究の柱として以下のものを設定する。
1．円順列変異体GroEL CP86-C4：CP86-C4変異体を用いた研究では，引き続きFlAsH-EDT2で特異的に修飾した変異体の性質決定と，ラベルが示す蛍光を指標にしたストップト・フロー解析を実施する。順調に実験が進めば，平成27年(研究課題最終年度)ではラベルに認識される配列モチーフの改変に挑戦したい。ポリペプチド鎖の各々の末端に2個ずつ導入されたシステインの位置を上流，下流にシフトさせることにより修飾後の性質を変え，より系統的なシャペロニンメカニズムの理解を目指す。
2．GroEL D398A変異体を用いた解析：ストップト・フロー解析により野生型GroELとの動的振る舞いの違いを確認したD398A変異体を用い，この変異体の機能障害を解消する新たな変異を探す。具体的にはランダム遺伝子変異法を用いてD398A変異体から大腸菌の生育を支える新たな変異体を作成，選別し，この新たな変異体を解析する。この実験はGroELサブユニットの中に潜んでいると思われる様々な「情報ネットワーク」の解明に向けた第一歩と位置づける。
3．新規変異体の評価：オーソドックスなシャペロニンメカニズムとは大きく異なる形で蛋白質のフォールディングを補助しているGroEL変異体を引き続き調べ，分子メカニズムに関する本質的な知見を得ることを目指す。
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