2014 Fiscal Year Research-status Report
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25440031
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
池水 信二 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (60333522)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
T細胞は免疫応答を司る主要な細胞であり、抗原の種類に応じて適したT細胞に分化することにより、抗原に適した免疫応答を誘導する。T細胞の分化にはサイトカインなどが関わっており、１型ヘルパーT細胞への初期の分化にはIL-27が、Th17細胞の活性化にはIL-23が関わっている。IL-23受容体は、IL-23に特異的なIL-23RとIL-12と共有されるIL-12Rβ1からなる。また、IL-27受容体は、特異的なWSX-1とIL-6等と共有されるGP130からなる。IL-23とIL-27はヘテロ二量体のサイトカインであり、IL-23は構造既知であるが、IL-27の構造は未だ明らかにされていない。また、ヘテロ二量体サイトカインと受容体の複合体の構造は明らかにされておらず、ヘテロ二量体サイトカインと受容体の認識機構に関する知見も得られていない。IL-23およびIL-27とこれらの受容体の認識機構を解明し、T細胞制御機構を構造生物学的に解明することが本研究の目的である。
IL-23Rについてはドメイン(D)1のみ、D1−D3のタンパク質を大腸菌で発現させた後精製を行った。その精製したD1を含むIL-23RがIL-23と結合することを確認した。IL-12Rβ1については、大腸菌では発現量が低かったため、昆虫細胞での発現系の構築を進めている。また、IL-27は２つのサブユニットが共有結合を介さない形で二量体を形成しているため不安定であったので、リンカーで繋いだタンパク質を調整した。また、WSX-1は調製方を確立して、様々な条件での結晶化を行ったが未だ結晶が得られていない。
今後、これらのタンパク質についてミリグラムオーダーで調製した後、複合体として精製をお行い、複合体の結晶化の調製を試みたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
WSX-1の調製法は、数年前に確立しており、様々な条件での結晶化をお試みたが未だ得られていない。IL-27と複合体として調製して、WSX-1の構造を安定化することによる結晶化が必要だと思われる。
IL-23受容体については、いずれも発現量が低いこと、特にIL-23Rについては、IL-23の結合領域と思われるD1を含む安定なタンパク質を得ることが難しく苦労している。現在、様々なコンストラクトを作成しながら、IL-23に結合して、かつ安定に調製できるIL-23Rのコンストラクトの作成を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
WSX-1については単独での結晶化が困難であると思われる。そこで、昆虫細胞を用いてWSX-1とIL-27を共発現させて複合体として調製した後、IL-27/WSX-1複合体の結晶化を行う。得られた結晶を用いて複合体の構造解析を行い、IL-27とWSX-1の認識機構を原子レベルで詳細に明らかにしたい。
IL-23RはD1含む試料の調製に苦労しているが、昆虫細胞で安定なタンパク質の調製を行いたい。また。IL-12Rβ1の昆虫細胞を用いた発現系の構築は進んでいるので、精製を行った後、IL-23との複合体として精製を行いたい。IL-23RとIL-12Rβ1を調製した後、IL−23との複合体として精製を行った後、これらの複合体の結晶化を進めて行く予定である。
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