真核生物細胞質における鉄硫黄クラスター合成マシーナリーの構造生物学

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25440034
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 庄村 康人 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (50423900)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 鉄硫黄クラスター / 金属タンパク質 / 分子シャペロン

Outline of Annual Research Achievements

真核生物においては，鉄硫黄クラスターを含むタンパク質は，ミトコンドリアと核および細胞質では別の経路で合成される．本研究では核・細胞質で機能する同システムに関与するタンパク質群について，単体および複合体での結晶構造解析を行い，合成経路およびその主要段階の反応機構を解明することを目的とする．
今年度は昨年度に引き続き，大腸菌を用いた各タンパク質（Nar1, Nbp35, Cia1, Cfd1）の発現系の構築および最適化をすすめた．分裂酵母由来のものは，Cia1（Cfd1との融合タンパク質）については昨年はタンパク質の産生が全く見られなかったが，cold-shockプロモータによるGST融合タンパク質として発現させたところ，大部分が不溶性成分として産生されることを確認した．一方，Nar1およびNbp35については大腸菌内で形成された金属クラスターが酸素に対して非常に不安定ではあったため，嫌気条件下で精製を試みたところ，安定かつ高純度の試料が得られるようになった．一方，Cfd1をもたないとされる線虫の系では，Cia1を高収量かつ高純度に調製するができ，その結晶化にも成功し，X線結晶構造を決定することができた．最高分解能は1.50Åで，非対称単位には3つのCia1分子が含まれており，それぞれ決まった構造をとらないループ領域が異なっていた．結晶中の分子のパッキングの影響であると考えられる．これまでに，出芽酵母由来およびヒト由来のCia1の結晶構造が報告されているが，それぞれのCα原子に対するRmsd値は，1.4, 1.1Åであり，立体構造はよく似ていることが分かった．分裂酵母ではCfd1とは融合タンパク質として結合しており，線虫ではCfd1を介さずにNbp35と相互作用すると考えられるが，微妙な構造の違いがこれらの相互作用の違いを与えていることが示唆された．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

4種類の構成要素のうち，これまでに結晶構造解析が完了しているのはCia1のみである．分裂酵母由来のNar1およびNbp35は素性もよく，嫌気条件下においては高純度かつ高収量で精製タンパク質が得られるが，結晶化条件はまだ分かっていない．線虫においては，Nbp35は，同様に試料調製は順調に進んでいるが，Nar1については発現量・収率ともに低く，これはタンパク質の安定性に起因するものと考えられる．

Strategy for Future Research Activity

Nar1およびNbp35の会合状態は嫌気条件下においては比較的均一であるこが分かっているため，結晶化を妨げているのは，ドメイン間の揺らぎもしくは特定の領域の揺らぎである可能性が高い．今後は，これらの部位を同定し，部位特異的変異の導入により，結晶化に特化した標的分子の調製を目指す．また，真核生物の発現系の構築にも着手する．好気条件下では不安定である点を考慮して，細胞破砕が嫌気条件下で行いやすい昆虫細胞の発現系をまず構築する．また，複合体としてのタンパク質調製をねらって，3者共発現も試みる．