2015 Fiscal Year Annual Research Report
真核生物細胞質における鉄硫黄クラスター合成マシーナリーの構造生物学
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25440034
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
庄村 康人 茨城大学, 理工学研究科, 准教授 (50423900)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 鉄硫黄クラスター / 金属タンパク質 / 分子シャペロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物細胞質の鉄硫黄クラスタータンパク質は，ミトコンドリアとは別の経路で合成される．本研究では核・細胞質で機能する同システムに関与するタンパク質群について，単体および複合体での結晶構造解析を行い，合成経路およびその主要段階の反応機構を解明することを目的とする．
今年度はこれまでにまだ得られていないNar1およびNbp35の単結晶を調製するため，それぞれのコンストラクトの最適化を試みた．両タンパク質ともに，N末端側に鉄硫黄クラスター前駆体を結合するドメインをもち，これが結晶化を妨げる立体構造的に不安定な領域であると考え，両タンパク質について限定分解を行った．鉄硫黄クラスター前駆体は嫌気条件下では比較的安定に保持され，好気条件下では速やかに分解される傾向が見られたため，両条件下において限定分解を行い，結果を比較したところ，やはり好気条件下において特定の領域が分解されやすい傾向が見られた．また，嫌気条件下で数日冷蔵保存した試料についても限定分解において顕著な分解が見られたことから，全長での結晶化は困難であると考え，N末端アミノ酸配列分析によって安定な領域を決定し，そのコンストラクトを作製した．その精製タンパク質は好気条件でも非常に安定であることが分かった．
また，各単体での結晶化は難しいが，複合体としての結晶化は有効であるという可能性が考えられたため，Nar1-Cia1およびCia1-Nbp35の複合体の調製を試みた．各タンパク質に異なるアフィニティータグを挿入し，さまざまな条件でプルダウンアッセイを行ったが，どの条件においても相互作用は確認されなかった．本研究で我々が対象としているのは線虫由来のCIA系であり，相互作用や機能解析が報告されているのは出芽酵母の系であることから，線虫にはこれまでに発見されていない足場タンパク質が存在するという可能性が示唆された．
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